Ablação de células a laser em larvas intactas de Drosophila revela competição sináptica
Summary
Este protocolo demonstra a ablação de células a laser de neurônios individuais em larvas intactas de Drosophila . O método permite o estudo do efeito da redução da competição entre neurônios no sistema nervoso em desenvolvimento.
Abstract
O protocolo descreve a ablação de um único neurônio com um sistema de laser de 2 fótons no sistema nervoso central (SNC) de larvas intactas de Drosophila melanogaster . Usando este método não invasivo, o sistema nervoso em desenvolvimento pode ser manipulado de maneira específica da célula. Interromper o desenvolvimento de neurônios individuais em uma rede pode ser usado para estudar como o sistema nervoso pode compensar a perda de entrada sináptica. Os neurônios individuais foram especificamente ablacionados no sistema de fibras gigantes de Drosophila, com foco em dois neurônios: a fibra gigante pré-sináptica (GF) e o neurônio motor tergotrochanteral pós-sináptico (TTMn). O GF faz sinapses com o TTMn ipsilateral, que é crucial para a resposta de escape. A ablação de um dos GFs no cérebro de3º ínstar, logo após o GF iniciar o crescimento axonal, remove permanentemente a célula durante o desenvolvimento do SNC. O GF restante reage ao vizinho ausente e forma um terminal sináptico ectópico para o TTMn contralateral. Este terminal atípico e bilateralmente simétrico inerva ambos os TTMns, como demonstrado pelo acoplamento de corante, e aciona ambos os neurônios motores, conforme demonstrado por ensaios eletrofisiológicos. Em resumo, a ablação de um único interneurônio demonstra competição sináptica entre um par bilateral de neurônios que pode compensar a perda de um neurônio e restaurar as respostas normais ao circuito de escape.
Introduction
A ablação a laser é uma ferramenta preferida para dissecar circuitos neurais em uma ampla variedade de organismos. Desenvolvido em sistemas genéticos modelo, como vermes e moscas, tem sido aplicado em todo o reino animal para estudar a estrutura, função e desenvolvimento do sistema nervoso 1,2,3. Aqui, a ablação de neurônio único foi empregada para investigar como os neurônios interagem durante a montagem do circuito em Drosophila. O sistema de escape da mosca é um circuito favorito para análise porque contém os maiores neurônios e as maiores sinapses da mosca adulta, e o circuito foi bem caracterizado nas últimas décadas4. O papel que as interações neurônio-neurônio desempenham na montagem do circuito de Fibra Gigante é um ponto focal desta pesquisa.
Um tipo de interação que tem sido um ponto focal na neurociência desde o trabalho de Hubel e Wiesel na década de 1960 é a “competição sináptica”5,6. Neste protocolo, a ablação a laser foi usada para revisitar o papel da competição por meio da ablação de célula única no sistema de fibras gigantes (GFS) de Drosophila, onde os fundamentos moleculares dos fenômenos podem ser descobertos.
A ablação de neurônios na mosca em desenvolvimento tem sido difícil por vários motivos, incluindo a visualização dos neurônios-alvo, a precisão do método de ablação e a sobrevivência da amostra. Para superar esses problemas no GFS, o sistema UAS / Gal47 foi usado para rotular neurônios de interesse, e um microscópio de dois fótons foi usado para remover a fibra gigante pré-sináptica ou o neurônio motor de salto pós-sináptico (TTMn).
Neste estudo, para determinar o papel que os neurônios bilaterais vizinhos desempenham no ajuste da conectividade sináptica e da força sináptica no GFS, um dos pares bilaterais de neurônios (GF pré-sináptico ou neurônio motor pós-sináptico) foi excluído pouco antes do desenvolvimento da pupa. Nesse estágio de desenvolvimento, a axonogênese da FG não foi concluída8. A estrutura do GF e a função do circuito sináptico no adulto foram então examinadas, com atenção especial dada à saída do GF restante.
Protocol
Representative Results
Discussion
A ablação celular com um microscópio de 2 fótons provou ser um método altamente bem-sucedido para manipular o desenvolvimento do circuito neuronal em Drosophila. Como esse método não é invasivo, causa danos mínimos ao animal. Os dados apóiam a utilidade dessa manipulação específica de células de circuitos conhecidos.
Crucial para o sucesso da ablação foi selecionar o driver Gal4 mais apropriado. Como o GFS é bem estudado, muitas linhas específicas de driver Gal4 fora…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Experimentos no microscópio de 2 fótons foram realizados no Núcleo de Imagem Celular Avançada do Instituto do Cérebro Stiles-Nicholson da FAU. Gostaríamos de agradecer à Jupiter Life Science Initiative pelo apoio financeiro.
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Anti-green fluorescent protein, rabbit | Fisher Scientific | A11122 | 1:500 concentration |
| Apo LWD 25x/1.10W Objective | Nikon | MRD77220 | water immersion long working distance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
| Cotton Ball | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila saline | recipe from Gu and O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Danger, Flammable liquid |
| Fly food B (Bloomington recipe) | LabExpress | 7001-NV | |
| Methyl salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Microscope cover-slip 18×18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Neurobiotin Tracer | Vector Laboratories | SP-1120 | |
| Nikon A1R multi-photon microscope | Nikon | on an upright FN1 microsope stand | |
| NIS Elements Advanced Research | Nikon | Acquisition and data analysis software | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salin) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tablets |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost microscope glass slide | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | detergent solution |
| UAS-10xGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 32185 |
References
- Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
- Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92 (2014).
- Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
- Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. 47, e2412 (2011).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. 52, e3080 (2011).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
- Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), (2018).
- Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).
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