無傷の ショウジョウバエ 幼虫のレーザー細胞アブレーションにより、シナプスの競合が明らかになる
Summary
このプロトコルは、無傷の ショウジョウバエ の幼虫の個々のニューロンのレーザー細胞アブレーションを示しています。この方法により、発達中の神経系におけるニューロン間の競争を減らす効果の研究が可能になります。
Abstract
このプロトコルは、無傷の ショウジョウバエ メラノガスター 幼虫の中枢神経系 (CNS) における 2 光子レーザー システムによる単一ニューロン アブレーションについて説明しています。この非侵襲的な方法を用いて、発生中の神経系を細胞特異的に操作することができる。ネットワーク内の個々のニューロンの発達を阻害することで、神経系がシナプス入力の喪失をどのように補うことができるかを研究することができます。 ショウジョウバエの巨大線維系では、シナプス前巨線維(GF)とシナプス後大転子運動ニューロン(TTMn)の2つのニューロンに焦点を当てて、個々のニューロンが特異的にアブレーションされました。GFは同側のTTMnとシナプスを形成し、これはエスケープ応答に重要です。GFが軸索成長を開始した直後に、第3インスター 脳のGFの1つを切除すると、CNSの発達中に細胞が永久に除去されます。残りのGFは不在の隣人に反応し、反対側のTTMnに対して異所性シナプス終末を形成します。この非定型の両側対称末端は、色素結合によって実証されるように両方のTTMnsを神経支配し、電気生理学的アッセイによって実証されるように両方の運動ニューロンを駆動します。要約すると、単一の介在ニューロンのアブレーションは、片側のニューロンの喪失を補い、エスケープ回路に対する正常な応答を回復できる両側のニューロンのペア間のシナプス競争を示しています。
Introduction
レーザーアブレーションは、さまざまな生物の神経回路を解剖するための好ましいツールです。ミミズやハエなどのモデル遺伝システムで開発され、神経系の構造、機能、および発達を研究するために動物界全体に適用されています1,2,3。ここでは、ショウジョウバエの回路組み立て中にニューロンがどのように相互作用するかを調べるために、単一ニューロンアブレーションが使用されました。ハエの脱出システムは、成虫のハエで最大のニューロンと最大のシナプスを含んでおり、その回路は過去数十年で十分に特徴付けられてきたため、分析のお気に入りの回路です4。ジャイアントファイバー回路の組み立てにおいてニューロン間相互作用が果たす役割は、この研究の焦点です。
1960年代のヒューベルとヴィーゼルの研究以来、神経科学で焦点となってきた相互作用の1つのタイプは、「シナプス競争」5,6です。このプロトコルでは、レーザーアブレーションを使用して、ショウジョウバエの巨大繊維系(GFS)における単一細胞アブレーションによる競争の役割を再検討し、現象の分子基盤が発見される可能性が示唆されました。
発育中のハエのニューロンのアブレーションは、標的ニューロンの可視化、アブレーション法の精度、標本の生存など、さまざまな理由で困難でした。GFSにおけるこれらの問題を克服するために、UAS/Gal4システム7 を用いて対象ニューロンを標識し、2光子顕微鏡を用いてシナプス前巨大線維またはシナプス後ジャンプ運動ニューロン(TTMn)を除去した。
本研究では、GFSにおけるシナプス結合性とシナプス強度の調整において、隣接する両側性ニューロンが果たす役割を明らかにするために、両側性ニューロンのペアの1つ(シナプス前GFまたはシナプス後運動ニューロン)を蛹の発生直前に欠失させた。この発生段階では、GF軸索形成は完了していません8。次に、成人のシナプス回路のGF構造と機能を調べ、残りのGFの出力に特に注意を払いました。
Protocol
Representative Results
Discussion
2光子顕微鏡による細胞アブレーションは、 ショウジョウバエの神経回路発達を操作するための非常に成功した方法であることが証明されました。この方法は非侵襲的であるため、動物へのダメージは最小限に抑えられます。このデータは、既知の回路のこの細胞特異的な操作の有用性を裏付けています。
アブレーションを成功させるために重要だったのは、最も…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
2光子顕微鏡での実験は、FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Coreで行われました。ジュピターライフサイエンス・イニシアティブの皆様には、多大なるご支援をいただき、誠にありがとうございます。
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Anti-green fluorescent protein, rabbit | Fisher Scientific | A11122 | 1:500 concentration |
| Apo LWD 25x/1.10W Objective | Nikon | MRD77220 | water immersion long working distance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
| Cotton Ball | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila saline | recipe from Gu and O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Danger, Flammable liquid |
| Fly food B (Bloomington recipe) | LabExpress | 7001-NV | |
| Methyl salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Microscope cover-slip 18×18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Neurobiotin Tracer | Vector Laboratories | SP-1120 | |
| Nikon A1R multi-photon microscope | Nikon | on an upright FN1 microsope stand | |
| NIS Elements Advanced Research | Nikon | Acquisition and data analysis software | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salin) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tablets |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost microscope glass slide | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | detergent solution |
| UAS-10xGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 32185 |
References
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