אבלציה של תאי לייזר בזחלי דרוזופילה שלמים חושפת תחרות סינפטית
Summary
פרוטוקול זה מדגים אבלציה של תאי לייזר של נוירונים בודדים בזחלי דרוזופילה שלמים. השיטה מאפשרת לחקור את ההשפעה של הפחתת התחרות בין תאי עצב במערכת העצבים המתפתחת.
Abstract
הפרוטוקול מתאר אבלציה של נוירון יחיד עם מערכת לייזר של 2 פוטונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) של זחלי Drosophila melanogaster שלמים. באמצעות שיטה לא פולשנית זו, ניתן לתפעל את מערכת העצבים המתפתחת באופן ספציפי לתא. שיבוש ההתפתחות של נוירונים בודדים ברשת יכול לשמש כדי לחקור כיצד מערכת העצבים יכולה לפצות על אובדן קלט סינפטי. תאי עצב בודדים הופעלו באופן ספציפי במערכת הסיבים הענקית של דרוזופילה, תוך התמקדות בשני נוירונים: סיב הענק הפרה-סינפטי (GF) והנוירון המוטורי הטרגוטרוצנטרלי הפוסט-סינפטי (TTMn). סינפסות ה-GF עם ה-TTMn האיפסילטרלי, שהוא חיוני לתגובת הבריחה. אבלציה של אחד ה-GFs במוח הכוכבהשלישי , מיד לאחר שה-GF מתחיל בצמיחה אקסונלית, מסירה לצמיתות את התא במהלך התפתחות מערכת העצבים המרכזית. ה-GF הנותר מגיב לשכן הנעדר ויוצר מסוף סינפטי חוץ רחמי ל-TTMn הנגדי. מסוף לא טיפוסי זה, סימטרי דו-צדדי, מעצבב את שני ה-TTMns, כפי שמודגם על-ידי צימוד צבעים, ומניע את שני תאי העצב המוטוריים, כפי שמודגם בבדיקות אלקטרופיזיולוגיות. לסיכום, אבלציה של נוירון יחיד מדגימה תחרות סינפטית בין זוג נוירונים דו-צדדיים שיכולים לפצות על אובדן של נוירון אחד ולהחזיר תגובות נורמליות למעגל המילוט.
Introduction
אבלציה בלייזר היא כלי מועדף לניתוח מעגלים עצביים במגוון רחב של אורגניזמים. הוא פותח במערכות גנטיות כמו תולעים וזבובים, והוא יושם ברחבי ממלכת החי כדי לחקור את המבנה, התפקוד וההתפתחות של מערכת העצבים 1,2,3. כאן, אבלציה של נוירון יחיד שימשה כדי לחקור כיצד נוירונים מתקשרים במהלך הרכבת מעגלים בדרוזופילה. מערכת המילוט של הזבוב היא מעגל מועדף לניתוח מכיוון שהיא מכילה את הנוירונים הגדולים ביותר ואת הסינפסות הגדולות ביותר בזבוב הבוגר, והמעגל אופיין היטב בעשורים האחרונים4. התפקיד שממלאות אינטראקציות נוירון-נוירון בהרכבת מעגל הסיבים הענק הוא מוקד המחקר הזה.
סוג אחד של אינטראקציה שהיה מוקד במדעי המוח מאז עבודתם של הובל וויזל בשנות השישים הוא “תחרות סינפטית”5,6. בפרוטוקול זה, אבלציה בלייזר שימשה כדי לבחון מחדש את תפקידה של התחרות באמצעות אבלציה חד-תאית במערכת הסיבים הענקית (GFS) של דרוזופילה, שם ניתן לגלות את היסודות המולקולריים של התופעות.
אבלציה של תאי עצב בזבוב המתפתח הייתה קשה ממגוון סיבות, כולל הדמיה של נוירוני המטרה, דיוק שיטת האבלציה והישרדות הדגימה. כדי להתגבר על בעיות אלה ב-GFS, מערכת UAS/Gal47 שימשה לסימון תאי עצב בעלי עניין, ומיקרוסקופ בעל שני פוטונים שימש להסרת הסיב הענק הפרה-סינפטי או נוירון מנוע הקפיצה הפוסט-סינפטי (TTMn).
במחקר זה, כדי לקבוע את התפקיד שתאי עצב דו-צדדיים שכנים ממלאים בהתאמת קישוריות סינפטית וחוזק סינפטי ב-GFS, אחד מזוגות תאי העצב הדו-צדדיים (GF קדם-סינפטי או נוירון מוטורי פוסט-סינפטי) נמחק ממש לפני התפתחות הגולם. בשלב התפתחותי זה, אקסונוגנזה GF לא הושלמה8. לאחר מכן נבדקו מבנה ה-GF ותפקודו של המעגל הסינפטי אצל הבוגר, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לתפוקה של ה-GF הנותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
אבלציה של תאים במיקרוסקופ של 2 פוטונים הוכחה כשיטה מוצלחת ביותר למניפולציה של התפתחות מעגלים עצביים בדרוזופילה. מכיוון ששיטה זו אינה פולשנית, היא גורמת נזק מינימלי לחיה. הנתונים תומכים בתועלת של מניפולציה ספציפית לתא זה של מעגלים ידועים.
קריטי להצלחת האבלציה היה בחירת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ניסויים במיקרוסקופ בעל 2 פוטונים בוצעו בליבת דימות התא המתקדמת של מכון המוח FAU סטיילס-ניקולסון. ברצוננו להודות ליוזמת יופיטר למדעי החיים על התמיכה הכספית.
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Anti-green fluorescent protein, rabbit | Fisher Scientific | A11122 | 1:500 concentration |
| Apo LWD 25x/1.10W Objective | Nikon | MRD77220 | water immersion long working distance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
| Cotton Ball | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila saline | recipe from Gu and O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Danger, Flammable liquid |
| Fly food B (Bloomington recipe) | LabExpress | 7001-NV | |
| Methyl salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Microscope cover-slip 18×18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Neurobiotin Tracer | Vector Laboratories | SP-1120 | |
| Nikon A1R multi-photon microscope | Nikon | on an upright FN1 microsope stand | |
| NIS Elements Advanced Research | Nikon | Acquisition and data analysis software | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salin) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tablets |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost microscope glass slide | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | detergent solution |
| UAS-10xGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 32185 |
References
- Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
- Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92 (2014).
- Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
- Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. 47, e2412 (2011).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. 52, e3080 (2011).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
- Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), (2018).
- Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).
.