Lasercelablatie in intacte Drosophila-larven onthult synaptische competitie
Summary
Dit protocol demonstreert de lasercelablatie van individuele neuronen in intacte Drosophila-larven . De methode maakt het mogelijk om het effect te bestuderen van het verminderen van competitie tussen neuronen in het zich ontwikkelende zenuwstelsel.
Abstract
Het protocol beschrijft ablatie met één neuron met een 2-foton lasersysteem in het centrale zenuwstelsel (CZS) van intacte Drosophila melanogaster larven. Met behulp van deze niet-invasieve methode kan het zich ontwikkelende zenuwstelsel op een celspecifieke manier worden gemanipuleerd. Het verstoren van de ontwikkeling van individuele neuronen in een netwerk kan worden gebruikt om te bestuderen hoe het zenuwstelsel het verlies van synaptische input kan compenseren. Individuele neuronen werden specifiek geablateerd in het gigantische vezelsysteem van Drosophila, met een focus op twee neuronen: de presynaptische reuzenvezel (GF) en het postsynaptische tergotrochanterale motorneuron (TTMn). De GF synapseert met de ipsilaterale TTMn, die cruciaal is voor de ontsnappingsreactie. Het ablateren van een van de GF’s in de3e instar hersenen, net nadat de GF axonale groei begint te starten, verwijdert de cel permanent tijdens de ontwikkeling van het CZS. De resterende GF reageert op de afwezige buur en vormt een ectopische synaptische terminal voor de contralaterale TTMn. Deze atypische, bilateraal symmetrische terminal innerveert beide TTMn’s, zoals aangetoond door kleurstofkoppeling, en drijft beide motorneuronen aan, zoals aangetoond door elektrofysiologische tests. Samenvattend, de ablatie van een enkel interneuron toont synaptische competitie tussen een bilateraal paar neuronen die het verlies van één neuron kunnen compenseren en de normale reacties op het ontsnappingscircuit kunnen herstellen.
Introduction
Laserablatie is een voorkeursinstrument voor het ontleden van neurale circuits in een breed scala aan organismen. Ontwikkeld in modelgenetische systemen zoals wormen en vliegen, is het in het hele dierenrijk toegepast om de structuur, functie en ontwikkeling van het zenuwstelsel te bestuderen 1,2,3. Hier werd ablatie met één neuron gebruikt om te onderzoeken hoe neuronen op elkaar inwerken tijdens de assemblage van het circuit in Drosophila. Het ontsnappingssysteem van de vlieg is een favoriet circuit voor analyse omdat het de grootste neuronen en de grootste synapsen in de volwassen vlieg bevat, en het circuit is deafgelopen decennia goed gekarakteriseerd. De rol die neuron-neuron-interacties spelen bij de assemblage van het Giant Fiber-circuit is een centraal punt van dit onderzoek.
Een type interactie dat sinds het werk van Hubel en Wiesel in de jaren 1960 een brandpunt is in de neurowetenschappen is “synaptische competitie”5,6. In dit protocol werd laserablatie gebruikt om de rol van competitie door middel van eencellige ablatie in het gigantische vezelsysteem (GFS) van Drosophila opnieuw te bekijken, waar de moleculaire onderbouwing van de verschijnselen zou kunnen worden ontdekt.
Ablatie van neuronen in de zich ontwikkelende vlieg was om verschillende redenen moeilijk, waaronder het visualiseren van de doelneuronen, de precisie van de ablatiemethode en de overleving van het exemplaar. Om deze problemen in het GFS op te lossen, werd het UAS/Gal4-systeem7 gebruikt om interessante neuronen te labelen, en een microscoop met twee fotonen werd gebruikt om de presynaptische reuzenvezel of het postsynaptische sprongmotorneuron (TTMn) te verwijderen.
In deze studie, om de rol te bepalen die naburige bilaterale neuronen spelen bij het aanpassen van synaptische connectiviteit en synaptische sterkte in het GFS, werd een van de bilaterale paren neuronen (presynaptische GF of postsynaptische motorneuron) verwijderd net voor de ontwikkeling van de pop. In dit ontwikkelingsstadium is de GF-axonogenese nog niet voltooid8. De GF-structuur en functie van het synaptische circuit bij de volwassene werden vervolgens onderzocht, met bijzondere aandacht voor de output van de resterende GF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Celablatie met een 2-fotonenmicroscoop bleek een zeer succesvolle methode te zijn om de ontwikkeling van neuronale circuits in Drosophila te manipuleren. Omdat deze methode niet-invasief is, veroorzaakt het minimale schade aan het dier. De gegevens ondersteunen het nut van deze celspecifieke manipulatie van bekende circuits.
Cruciaal voor het succes van de ablatie was het selecteren van de meest geschikte Gal4-driver. Aangezien het GFS goed bestudeerd is, zijn er veel specifieke Gal4-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Experimenten met de 2-fotonmicroscoop werden uitgevoerd in de FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Core. We willen het Jupiter Life Science Initiative bedanken voor de financiële steun.
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Anti-green fluorescent protein, rabbit | Fisher Scientific | A11122 | 1:500 concentration |
| Apo LWD 25x/1.10W Objective | Nikon | MRD77220 | water immersion long working distance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
| Cotton Ball | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila saline | recipe from Gu and O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Danger, Flammable liquid |
| Fly food B (Bloomington recipe) | LabExpress | 7001-NV | |
| Methyl salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Microscope cover-slip 18×18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Neurobiotin Tracer | Vector Laboratories | SP-1120 | |
| Nikon A1R multi-photon microscope | Nikon | on an upright FN1 microsope stand | |
| NIS Elements Advanced Research | Nikon | Acquisition and data analysis software | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salin) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tablets |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost microscope glass slide | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | detergent solution |
| UAS-10xGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 32185 |
References
- Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
- Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92 (2014).
- Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
- Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. 47, e2412 (2011).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. 52, e3080 (2011).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
- Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), (2018).
- Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).
.