الاجتثاث بالليزر للخلايا في يرقات ذبابة الفاكهة السليمة يكشف عن منافسة متشابكة
Summary
يوضح هذا البروتوكول استئصال الخلايا العصبية الفردية بالليزر في يرقات ذبابة الفاكهة السليمة. تمكن هذه الطريقة من دراسة تأثير تقليل المنافسة بين الخلايا العصبية في الجهاز العصبي النامي.
Abstract
يصف البروتوكول الاجتثاث أحادي الخلية العصبية بنظام ليزر 2 فوتون في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ليرقات ذبابة الفاكهة الميلانية السليمة. باستخدام هذه الطريقة غير الغازية ، يمكن التلاعب بالجهاز العصبي النامي بطريقة خاصة بالخلية. يمكن استخدام تعطيل تطور الخلايا العصبية الفردية في الشبكة لدراسة كيف يمكن للجهاز العصبي تعويض فقدان المدخلات المشبكية. تم استئصال الخلايا العصبية الفردية على وجه التحديد في نظام الألياف العملاقة لذبابة الفاكهة ، مع التركيز على اثنين من الخلايا العصبية: الألياف العملاقة قبل المشبكية (GF) والخلايا العصبية الحركية tergotrochanteral بعد المشبكي (TTMn). يتشابك GF مع TTMn المماثل ، وهو أمر بالغ الأهمية لاستجابة الهروب. الاجتثاث واحد من GFs في الدماغ 3الثالثة instar ، مباشرة بعد GF يبدأ النمو المحوري ، يزيل الخلية بشكل دائم أثناء تطوير الجهاز العصبي المركزي. يتفاعل GF المتبقي مع الجار الغائب ويشكل طرفا متشابك خارج الرحم إلى TTMn المقابل. هذا الطرف غير النمطي المتماثل ثنائيا يعصب كلا من TTMns ، كما يتضح من اقتران الصبغة ، ويدفع كلا الخلايا العصبية الحركية ، كما يتضح من المقايسات الفيزيولوجية الكهربية. باختصار ، يوضح استئصال خلية عصبية واحدة منافسة متشابكة بين زوج ثنائي من الخلايا العصبية التي يمكن أن تعوض عن فقدان خلية عصبية واحدة واستعادة الاستجابات الطبيعية لدائرة الهروب.
Introduction
الاستئصال بالليزر هو أداة مفضلة لتشريح الدوائر العصبية في مجموعة واسعة من الكائنات الحية. تم تطويره في أنظمة وراثية نموذجية مثل الديدان والذباب ، وقد تم تطبيقه في جميع أنحاء المملكة الحيوانية لدراسة بنية ووظيفة وتطور الجهاز العصبي1،2،3. هنا ، تم استخدام استئصال الخلايا العصبية المفردة للتحقيق في كيفية تفاعل الخلايا العصبية أثناء تجميع الدائرة في ذبابة الفاكهة. نظام الهروب من الذبابة هو دائرة مفضلة للتحليل لأنه يحتوي على أكبر الخلايا العصبية وأكبر نقاط الاشتباك العصبي في الذبابة البالغة ، وقد تم تمييز الدائرة بشكل جيد في العقود الماضية4. الدور الذي تلعبه التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا العصبية في تجميع دائرة الألياف العملاقة هو نقطة محورية في هذا البحث.
نوع واحد من التفاعل الذي كان نقطة محورية في علم الأعصاب منذ عمل Hubel و Wiesel في ستينيات القرن العشرين هو “المنافسة متشابك”5,6. في هذا البروتوكول ، تم استخدام الاستئصال بالليزر لإعادة النظر في دور المنافسة من خلال الاجتثاث أحادي الخلية في نظام الألياف العملاقة (GFS) لذبابة الفاكهة ، حيث يمكن اكتشاف الأسس الجزيئية للظواهر.
كان استئصال الخلايا العصبية في الذبابة النامية صعبا لعدة أسباب ، بما في ذلك تصور الخلايا العصبية المستهدفة ، ودقة طريقة الاجتثاث ، وبقاء العينة. للتغلب على هذه المشاكل في GFS ، تم استخدام نظام UAS / Gal47 لتسمية الخلايا العصبية ذات الأهمية ، وتم استخدام مجهر ثنائي الفوتون لإزالة الألياف العملاقة قبل المشبكية أو الخلايا العصبية الحركية بعد المشبكي (TTMn).
في هذه الدراسة ، لتحديد الدور الذي تلعبه الخلايا العصبية الثنائية المجاورة في ضبط الاتصال المشبكي والقوة المشبكية في GFS ، تم حذف أحد الأزواج الثنائية من الخلايا العصبية (إما GF قبل المشبكي أو الخلايا العصبية الحركية بعد المشبكي) قبل تطور العذراء مباشرة. في هذه المرحلة التنموية ، لم يكتمل تكوين محور GF8. ثم تم فحص بنية GF ووظيفة الدائرة المشبكية في البالغين ، مع إيلاء اهتمام خاص لإخراج GF المتبقي.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثبت الاجتثاث الخلوي باستخدام مجهر 2 فوتون أنه طريقة ناجحة للغاية لمعالجة تطور الدائرة العصبية في ذبابة الفاكهة. نظرا لأن هذه الطريقة غير جراحية ، فإنها تسبب الحد الأدنى من الضرر للحيوان. تدعم البيانات فائدة هذا التلاعب الخاص بالخلية للدوائر المعروفة.
كان من الأهمية ب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إجراء تجارب على مجهر 2 فوتون في معهد FAU Stiles-Nicholson Brain Imaging Core المتقدم للخلايا. نود أن نشكر مبادرة علوم الحياة كوكب المشتري على الدعم المالي.
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Anti-green fluorescent protein, rabbit | Fisher Scientific | A11122 | 1:500 concentration |
| Apo LWD 25x/1.10W Objective | Nikon | MRD77220 | water immersion long working distance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
| Cotton Ball | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila saline | recipe from Gu and O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Danger, Flammable liquid |
| Fly food B (Bloomington recipe) | LabExpress | 7001-NV | |
| Methyl salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Microscope cover-slip 18×18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Neurobiotin Tracer | Vector Laboratories | SP-1120 | |
| Nikon A1R multi-photon microscope | Nikon | on an upright FN1 microsope stand | |
| NIS Elements Advanced Research | Nikon | Acquisition and data analysis software | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salin) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tablets |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost microscope glass slide | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | detergent solution |
| UAS-10xGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 32185 |
References
- Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
- Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92 (2014).
- Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
- Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. 47, e2412 (2011).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. 52, e3080 (2011).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
- Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), (2018).
- Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).
.