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Bioengineering

Extracción continua líquido-líquido de ácidos grasos de cadena media a partir de caldos de fermentación mediante membranas de fibra hueca

Published: August 09, 2024
doi:
10.3791/66956
, ,
1Department of Food Science and Technology,University of Georgia, 2New Materials Institute,University of Georgia, 3Institute for Integrative Agriculture, Office of Research,University of Georgia

Summary

Se desarrolló un sistema de extracción líquido-líquido (LLE) que involucra membranas de fibra hueca para extraer de manera continua y selectiva ácidos grasos de cadena media (AGCM) del caldo de fermentación. El sistema LLE logra altas especificidades de AGCM a partir de caldos que contienen ácidos grasos de cadena corta y alcoholes. Además, los AGCM se concentran en una solución de decapado para facilitar la recuperación del producto.

Abstract

Los ácidos grasos de cadena media (AGCM; longitudes de carbono: C6-C12) son productos químicos de plataforma de alto valor que sirven para una variedad de aplicaciones industriales, incluidos antimicrobianos verdes, ingredientes alimentarios, aditivos para alimentos animales, cosméticos, fragancias, productos farmacéuticos y lípidos estructurados. Actualmente, la mayoría de los AGCM se producen a partir de aceite de palma y coco originario del sudeste asiático y América del Sur. El enfoque convencional para la recolección de frutos de palma y coco causa un daño ecológico considerable en estas regiones. Por lo tanto, los investigadores están desarrollando enfoques biológicos (por ejemplo, fermentaciones de precisión y de cultivo abierto) para generar AGCM de manera más sostenible utilizando sustratos de bajo valor (por ejemplo, metanol, etanol, lactato) o desechos orgánicos como materia prima. La elongación de la cadena microbiana (CE) es una plataforma de fermentación de cultivo abierto de rápida maduración que convierte los ácidos grasos de cadena corta (AGCC; longitudes de carbono: C1-C5) en un subconjunto de estos AGCM a tasas industrialmente relevantes. Sin embargo, la extracción continua in situ de los productos de AGCM es necesaria no solo para evitar la inhibición del producto, sino también para facilitar la recuperación de AGCM en una forma pura y utilizable. La extracción líquido-líquido (LLE, por sus siglas en inglés) utilizando membranas de fibra hueca y mezclas de extractos específicos ha demostrado ser un enfoque sólido para extraer selectivamente productos de AGCM de caldos de fermentación que contienen AGCC. Aquí, se demuestra la aplicación de LLE para la eliminación continua de AGCM utilizando CE como sistema de fermentación de referencia y óxido de trioctilfosfina al 3% (p/v) en aceite mineral como sistema extractante. Los ácidos grasos, que van desde el ácido valérico (C5) hasta el ácido caprílico (C8), se eliminan selectivamente de los caldos que contienen AGCC y se concentran en títulos altos en una solución de extracción alcalina semidiscontinua para el procesamiento posterior.

Introduction

Los ácidos grasos de cadena media (AGCM) son productos químicos de alto valor que comprenden longitudes de cadena que oscilan entre seis (C6) y doce (C12) carbonos. Los AGCM tienen aplicaciones industriales en alimentos, alimentos para animales, productos farmacéuticos, cosméticos, fragancias, agentes antimicrobianos y síntesis química 1,2,3. En la actualidad, la mayoría de los AGCM se derivan del aceite de palma y coco procedente del sudeste asiático y América del Sur 4,5. El grave daño ecológico asociado con la producción de aceite de palma y coco es bien reconocido por las partes interesadas y el público en general. Los investigadores están explorando enfoques biológicos (por ejemplo, fermentaciones de precisión y de cultivo abierto) para generar AGCM de manera más sostenible utilizando sustratos de bajo valor o desechos orgánicos como materia prima 6,7. Una forma sostenible de producir AGCM es reciclar los flujos de residuos orgánicos mediante un proceso llamado elongación de la cadena microbiana (EC). Este bioproceso de fermentación secundaria es similar a la digestión anaeróbica en el sentido de que explota la versatilidad de los microbiomas anaeróbicos de cultivo abierto, pero en lugar de promover la formación de metano, los sistemas de CE suprimen deliberadamente la vía metanogénica. En un microbioma en el que el carbono no puede reducirse al máximo aCH4, ni elH2 puede mantenerse por debajo de 10-4 atm por arqueas consumidoras de hidrógeno, la reacción de β-oxidación que normalmente descompondría los carboxilatos de cadena más larga en acetato (por ejemplo, C6 → C4 → C2) puede invertirse (por ejemplo, C2 → C4 → C6, etc.), siempre que un compuesto reducido (es decir, donante de electrones) como etanol o lactato8. En este metabolismo, la molécula de ácido graso que sufre elongación sirve como aceptor de electrones. Por lo tanto, en lugar de generar un producto con una longitud de carbono de uno (CH4) como en la digestión anaeróbica, el proceso de CE genera AGCM con longitudes de carbono que oscilan entre seis y ocho. Un mercado grande y en crecimiento está listo para recibir estos productos químicos de plataforma verde. Sin embargo, hasta ahora, no se ha demostrado que el proceso de CE produzca AGCM con longitudes de carbono superiores a ocho carbonos a tasas apreciables.

La extracción eficiente de estos AGCM es importante no solo para la recuperación del producto deseado, sino también para prevenir la inhibición del producto y empujar al microbioma hacia la producción de más AGCM. A medida que aumenta la concentración de AGCM, el metabolismo de los AGCM se inhibe y se vuelve menos favorable termodinámicamente. Al eliminar los AGCM de forma continua, se mantienen los índices de producción. Además, debido a que los AGCC sirven como subestructuras para el proceso de elongación de la cadena, no deben eliminarse del caldo de fermentación. Las mezclas de extractos específicos deben extraer selectivamente los productos de AGCM de los caldos de fermentación que contengan AGCC.

Aquí, se demuestra un enfoque robusto y práctico para extraer continuamente MCFA de caldos de fermentación que contienen AGCC utilizando un sistema de extracción líquido-líquido (LLE) que comprende un extractor hidrofóbico de membrana de fibra hueca de polipropileno, una solución de extractante orgánico selectivo (óxido de trioctilfosfina [TOPO]9,10,11), y un extractor de membrana de fibra hueca hacia atrás. Se instala un filtro de protección de celdas aguas arriba del sistema LLE para retener la biomasa y mitigar el ensuciamiento de la membrana. Los AGCM se extraen hacia adelante, en su forma protonada, del caldo de fermentación acuoso (generalmente con un punto de ajuste de pH <5.8) a una solución de extracción orgánica (es decir, 3% de TOPO (p/v) en aceite mineral) y luego se extraen hacia atrás en una solución de extracción alcalina (pH = 9), donde se desprotonan y se concentran a títulos altos para el procesamiento posterior. Los puntos de ajuste de pH particulares son esenciales porque dictan el gradiente de concentración entre cada fase del proceso LLE, lo que garantiza una transferencia neta de MCFA del caldo de fermentación a la solución de stripping. El uso de LLE membranas de extracción hacia adelante y hacia atrás logra altas tasas de extracción al tiempo que minimiza la coextracción de alcoholes y AGCC. El adyuvante solvente orgánico, TOPO, permite la formación de complejos MCFA. Estos complejos son más solubles en fases orgánicas que en agua, lo que resulta en una alta selectividad de MCFA. El proceso de LLE también evita las muchas desventajas asociadas con los enfoques existentes, que se discutirán en la sección de Discusión. La implementación a largo plazo utilizando este enfoque de LLE ha sido demostrada en múltiples estudios 9,10,11. Si bien este enfoque es particularmente adecuado para aplicaciones que involucran la producción de AGCM a través de la elongación de la cadena microbiana, también es útil en otras aplicaciones que requieren la separación selectiva de compuestos que poseen propiedades químicas similares porque el sistema de extracción orgánica se puede personalizar.

Protocol

Los reactivos, consumibles y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales. 1. Construcción e integración del biorreactor y del sistema de extracción líquido-líquido Prepare la solución de extracción en fase orgánica y el depósito.Prepare 2 L de solución de extracción en fase orgánica disolviendo 60 g de óxido de trioctilfosfina (TOPO) en aceite mineral utilizando una placa de agitación magnética y un agitador. Agregue la solución de extracción a un depósito de vidrio de 2 L (es decir, una botella Schott). Coloque el depósito en una placa de agitación magnética (Figura 1A). La velocidad de mezcla recomendada durante el funcionamiento continuo de LLE es de 150-250 rpm. Prepare una tapa de tres puertos para el depósito de solución de extracción.Conecte un tubo de inmersión al primer puerto para que sirva como puerto de salida que suministre solución de extracción a la membrana de extracción directa (FEM) (Figura 1B). Coloque un segundo puerto para que sirva como puerto de retorno para la solución de extracción de la membrana de extracción hacia atrás (BEM) (Figura 1C). Agregue un tercer puerto, abierto a la atmósfera, para amortiguar las fluctuaciones de presión causadas por la bomba de diafragma. Conecte la bomba de diafragma a las membranas de extracción.Coloque un accionamiento de bomba de velocidad variable de 100 rpm equipado con un cabezal de bomba de diafragma de politetrafluoroetileno (PTFE) adyacente al depósito (Figura 1D). Conecte el puerto de salida del depósito de solución de extracción (Figura 1A) a la entrada de la bomba de diafragma y luego la salida de la bomba de diafragma a la entrada del lado de la carcasa en la base del FEM (Figura 1B) utilizando el tubo flexible de la bomba (por ejemplo, tamaño 16, 18). Conecte la salida del lado de la carcasa en la parte superior del FEM a la entrada del lado de la carcasa en la base del BEM (Figura 1C) utilizando un tubo de bomba flexible (por ejemplo, tamaño 18). Conecte la salida del lado de la carcasa en la parte superior del BEM al puerto de retorno en el depósito de solución de extracción (Figura 1A) utilizando un tubo de bomba flexible (por ejemplo, tamaño 16, 18).NOTA: Este componente del sistema transfiere los AGCM extraídos del caldo de fermentación en el FEM a la solución de extracción en el BEM. Prepare la solución de extracción en fase acuosa y el depósito.Prepare 3,25 L de solución de extracción en fase acuosa tomando una solución de ácido bórico de 0,5 M y ajustándola a pH 9 utilizando NaOH. Vierta la solución en un depósito de vidrio de 3,5 L con una barra agitadora magnética. Coloque el depósito en una placa de agitación magnética (Figura 1E). Prepare una tapa de cuatro puertos para el depósito de solución de pelado.Conecte un tubo de inmersión al primer puerto para que sirva como puerto de salida que suministre solución de extracción al BEM. Coloque un segundo puerto que comprenda un accesorio en Y para que (1) sirva como puerto de flujo de retorno de la solución de extracción del BEM y (2) sirva como corriente de arrastre para las adiciones de NaOH del sistema de control de pH. Agregue un tercer puerto, abierto a la atmósfera, para tener en cuenta el aumento de volumen causado por las adiciones de NaOH y la acumulación de AGCM. Proporcione un cuarto puerto para acomodar la sonda de pH del controlador de pH. Instale un sistema de control de pH en el depósito de la solución de extracción.Integre un sistema de control de pH con un punto de ajuste de pH 9 con el depósito de solución de extracción (Figura 1F). Utilice 5 M de NaOH como solución base con el controlador de pH para contrarrestar los AGCM recogidos. Inserte la sonda de pH a través del puerto del depósito de solución de extracción y cuélguela en la solución de extracción.NOTA: Este sistema de control de pH no requiere una solución ácida. Prepare los puertos de conexión del biorreactor.Designe dos puertos, un puerto de salida y un puerto de flujo de retorno, en el biorreactor para la conexión con el sistema de extracción líquido-líquido (LLE) (Figura 1G, H). Conecte un tubo de inmersión al puerto de salida. El caldo rico en MCFA se bombeará desde el biorreactor en el puerto de salida al sistema LLE.NOTA: El caldo primero ingresa al filtro de membrana de fibra hueca antes que las membranas de extracción para eliminar las células y otros sólidos para evitar el ensuciamiento. Inserte un accesorio en T en el puerto de flujo de retorno para recibir: (1) caldo agotado en MCFA reciclado del FEM y (2) retenido que contiene celdas del filtro de membrana de fibra hueca. Instale el filtro de membrana de fibra hueca.Coloque un accionamiento de bomba de velocidad variable de 300 rpm adyacente al biorreactor (Figura 1I). Fije la membrana hidrofílica de fibra hueca (Figura 1J) a un soporte de anillo sobre la bomba peristáltica. Apile dos cabezales de bomba peristáltica en el accionamiento de la bomba, grande (p. ej., tamaño 17) y pequeño (p. ej., tamaño 16).NOTA: El cabezal de la bomba más grande está conectado al filtro de membrana de fibra hueca para garantizar que el caudal de permeado sea mayor que el caudal que alimenta el FEM. Si este no fuera el caso, el permeado se consumiría más rápido de lo que se produce, lo que provocaría la formación de un vacío. Conecte el puerto de salida del biorreactor a la entrada del cabezal de la bomba grande mediante un tubo de bomba flexible (por ejemplo, tamaño 17). Conecte la salida grande del cabezal de la bomba al filtro de membrana hidrofílico de fibra hueca en la entrada del lado del tubo en la base del filtro utilizando un tubo de bomba flexible (por ejemplo, tamaño 17). Tape el puerto superior del lado de la carcasa del filtro para evitar la entrada de aire.NOTA: El caldo rico en MCFA (que contiene células) fluirá hacia arriba a través de los tubos de fibra hueca y regresará al biorreactor. El caldo claro (sin células) pasará a través de la membrana de polietersulfona hidrofílica (PES) de 0,2 μm y se acumulará en el lado de la carcasa del filtro. Conecte el FEM.Fije el primer módulo de membrana de fibra hueca (FEM) hidrofóbico a un soporte de anillo sobre la bomba (Figura 1B). Conecte el filtro de membrana hidrofílico de fibra hueca (Figura 1J) en la salida del lado de la carcasa a la entrada del cabezal de la bomba pequeña utilizando un tubo de bomba flexible (por ejemplo, tamaño 16, 18). Conecte la pequeña salida del cabezal de la bomba al FEM en la entrada del lado del tubo en la base del módulo utilizando un tubo de bomba flexible (por ejemplo, tamaño 16, 18). Conecte el manómetro (Figura 1K) y la válvula de restricción de flujo (Figura 1L) a la salida del lado del tubo del FEM mediante un accesorio de acoplamiento y un accesorio en T. Conecte la salida del lado del tubo del FEM al puerto de retorno del biorreactor mediante un tubo de bomba flexible (por ejemplo, tamaño 18).NOTA: Este componente del sistema transfiere los AGCM del caldo de fermentación claro a la solución de extracción y luego devuelve el caldo claro al biorreactor. Conecte el BEM.Coloque un accionamiento de bomba de velocidad variable de 300 rpm equipado con un cabezal de bomba peristáltico (por ejemplo, tamaño 16) adyacente al biorreactor (Figura 1M). Fije el segundo módulo de membrana hidrofóbica de fibra hueca a un soporte de anillo sobre la bomba peristáltica (Figura 1C). Conecte el puerto de salida del depósito de solución de extracción a la entrada de la bomba peristáltica y la salida de la bomba a la entrada del lado del tubo en la base del BEM utilizando un tubo de bomba flexible (por ejemplo, tamaño 16, 18). Conecte el manómetro y la válvula de restricción de flujo a la salida del lado del tubo del BEM mediante un accesorio de acoplamiento y un accesorio en T. Conecte la salida del lado del tubo en la parte superior del BEM al puerto de flujo de retorno del depósito de solución de extracción utilizando un tubo de bomba flexible (por ejemplo, tamaño 16, 18).NOTA: Este componente del sistema transfiere los MCFA de la solución de extracción a la solución de extracción en el BEM y luego devuelve la solución de extracción a su depósito. 2. Inicio del funcionamiento del sistema de extracción líquido-líquido Cebar y hacer circular las líneas de fase acuosa.Encienda la bomba peristáltica de solución de extracción/BEM (Figura 1M) y ajuste la velocidad de la bomba para lograr un caudal constante entre 25-250 mL·min-1. El BEM puede acomodar una gama relativamente amplia de caudales. Comience con un caudal conservador alto inicialmente para garantizar una extracción suficiente de AGCM. El caudal se puede reducir gradualmente más adelante durante la operación para prolongar la vida útil del equipo de bombeo y la tubería.NOTA: La velocidad del flujo no debe ser tan baja como para permitir una acumulación de AGCM en el caldo del biorreactor (ver Resultados Representativos). Cierre lentamente la válvula de aguja en la salida del lado de la carcasa del BEM (Figura 1C) para establecer una contrapresión de ~ 5 psig. Encienda el biorreactor/bomba peristáltica FEM (Figura 1I) y ajuste la velocidad de la bomba para lograr un caudal constante entre 25-250 mL·min-1. El FEM puede acomodar una gama relativamente grande de caudales. Comience con un caudal conservador alto inicialmente para garantizar una extracción suficiente de AGCM. El caudal se puede reducir gradualmente más adelante durante la operación para prolongar la vida útil del equipo de bombeo y la tubería.NOTA: La velocidad del flujo no debe ser tan baja como para permitir una acumulación de AGCM en el caldo del biorreactor (consulte la sección de Resultados representativos). Cierre lentamente la válvula de aguja en la salida del lado de la carcasa del FEM (Figura 1B) para establecer una contrapresión de ~ 5 psig. Verifique visualmente las líneas de flujo de retorno para garantizar un flujo constante y que las líneas se hayan cebado. Verifique que se recoja caldo claro dentro del lado de la cáscara del filtro de membrana de fibra hueca (Figura 1J).NOTA: Se necesitarán varias horas para llenar el FEM y establecer un flujo constante entre el filtro de membrana de fibra hueca y el FEM. La velocidad del flujo no debe ser tan baja como para permitir una acumulación de AGCM en el caldo del biorreactor (consulte la sección Resultados representativos). Cebar y hacer circular las líneas de fase orgánica.Encienda la bomba de diafragma de solución de extracción en fase orgánica (Figura 1D) y ajuste la velocidad de la bomba para lograr un caudal constante entre 5,0 y 50 mL·min-1. Comience con un caudal conservador y bajo inicialmente para minimizar la presión en la extracción en fase orgánica y minimizar el riesgo de cruce. Si es necesario, el caudal se puede aumentar gradualmente más adelante durante el funcionamiento para mejorar la eficiencia de la extracción Espere hasta que se llenen el FEM y el BEM. Verifique visualmente el puerto de flujo de retorno en el depósito de solución de extracción para garantizar un flujo constante. Verifique que ninguna solución de fase orgánica esté cruzando a la solución de extracción o a las líneas de caldo de fermentación. Si se produce un cruce, se pueden ver pequeñas gotas de la fase orgánica. Si esto sucede, disminuya la velocidad de la bomba de diafragma y aumente ligeramente la contrapresión en el FEM o BEM según corresponda. No exceda los 10 psig.NOTA: Para evitar el cruce de membranas, es importante establecer el flujo y la contrapresión dentro de las líneas de fase acuosa antes de cebar las líneas de fase orgánica. Extraer continuamente los AGCM del biorreactor.El sistema LLE debe estar en pleno funcionamiento. Permitir que el sistema funcione continuamente durante el funcionamiento del biorreactor. Mida diariamente las concentraciones de AGCM en el biorreactor para garantizar una extracción suficiente de AGCM. Si se producen concentraciones elevadas de AGCM en el biorreactor, generalmente indican caudales insuficientes del caldo de fermentación a través del MEF. También puede indicar una disminución del flujo de la membrana debido al ensuciamiento y la necesidad de mantenimiento (consulte el paso 2.6).NOTA: Las concentraciones de AGCC y AGCM pueden medirse mediante cromatografía de gases según el método descrito por Ge et al.11. Monitoree la acumulación de MCFA en el depósito de solución de extracción.Mida la concentración de AGCM dentro de la solución de extracción diariamente durante el ciclo del lote. El sistema LLE transfiere continuamente MFCA del biorreactor a la solución de extracción, aumentando la concentración de MCFA con el tiempo. El proceso puede ejecutarse durante períodos prolongados para producir títulos altos de MCFA. La tasa de producción volumétrica de AGCM (mM C·L-1·d-1) puede estimarse utilizando la Ecuación 111.NOTA: Tasa de producción volumétrica = (Ec. 1)Dónde:Cb,n= Concentración de AGCM en el caldo de fermentación el día n, mM CCs,n= Concentración de AGCM en la solución de extracción en el día n, mM CCs,n-1= Concentración de AGCM en la solución de extracción en el día n-1, mM CVs,n= Volumen de la solución de extracción en el día n, LVb,n= Volumen de caldo de fermentación (volumen del biorreactor) en el día n, LHRTn= Tiempo de retención hidráulica del biorreactor en el día n, dTn= Día n, dTn-1= Día n-1, d Para garantizar un funcionamiento estable, calcule periódicamente la tasa de extracción (mM C·d-1) del sistema LLE midiendo el cambio en la concentración de AGCM entre los puntos de tiempo de medición y aplicando la Ecuación 211.NOTA: (Ec. 2)Dónde:Cs,n= Concentración de AGCM en la solución de extracción en el día n, mM CCs,n-1= Concentración de AGCM en la solución de extracción en el día n-1, mM CVs,n= Volumen de la solución de extracción en el día n, LTn= Día n, dTn-1= Día n-1, d Para mantener tasas de transferencia adecuadas de la solución de extracción, reemplace la solución de extracción con un lote nuevo antes de que la concentración de MCFA alcance el 80% de saturación.NOTA: La solubilidad máxima del ácido n-caproico es de 10,3 g· L-1 a 25 °C, y el del ácido n-caprílico es de 0,67 g· L-1 a 25 °C. Reemplace la solución de pelado.Apague la bomba de diafragma (Figura 1D). Apague la bomba peristáltica de solución de extracción (Figura 1M). Utilice abrazaderas de manguera para sujetar la entrada del lado del tubo y la salida del lado del tubo del BEM. Apague el sistema de control de pH y retire la tapa del depósito de solución de extracción mientras mantiene las conexiones de puerto conectadas (si es posible). Retire el depósito de solución de extracción (Figura 1E). Sustituya el depósito de solución de extracción por una nueva tanda de solución acuosa de ácido bórico 0,5 M ajustada a pH 9 utilizando NaOH (véase el paso 1.4). Vuelva a colocar la tapa en el depósito. Retire las abrazaderas de manguera de la entrada del lado del tubo y de la salida del lado del tubo del BEM. Encienda la bomba peristáltica de solución de extracción (Figura 1M), seguida de la bomba de diafragma (Figura 1D). El funcionamiento del sistema ahora está restaurado. Mantenimiento de membranas.Retire el FEM y el BEM del sistema LLE una vez cada tres meses para limpiarlos. Tres meses es una frecuencia de limpieza estimada conservadora.NOTA: Dependiendo de la aplicación, los usuarios pueden limpiar las membranas con mayor o menor frecuencia. Los signos de disminución del rendimiento de la membrana se describen en la sección Resultados representativos. Durante el mantenimiento, las bombas y el controlador de pH deben estar apagados. Las instrucciones de limpieza deben ser proporcionadas por el fabricante de la membrana. Drene los líquidos del sistema LLE en recipientes separados, comenzando con las líneas de solución de extracción en fase orgánica, seguidas de las líneas de caldo de fermentación y las líneas de solución de decapado. Una vez que las membranas se limpien y se vuelvan a instalar, devuelva los líquidos a sus respectivos depósitos. Vuelva a iniciar el sistema LLE utilizando el enfoque descrito anteriormente (consulte los pasos 2.1-2.2).

Representative Results

Los resultados positivos de la extracción de AGCM están indicados por una acumulación constante de productos de AGCM en la solución de extracción en fase acuosa alcalina (Figura 2) y concentraciones relativamente estables de AGCM en el caldo de fermentación (datos no mostrados). La Figura 2 ilustra tres ciclos semi-batch de la solución de pelado durante el funcionamiento continuo de LLE. Un ciclo consta de dos etapas: la etapa de reemplazo de lotes (Figura 2: Día 24, Día 46 y Día 68) y la etapa de acumulación de AGCM (Figura 2: Días 0-24, Días 25-46, Días 47-68). Para este sistema de fermentación y LLE en particular, la duración del ciclo fue de aproximadamente 20-24 días. Sin embargo, la duración del ciclo variará entre aplicaciones, ya que depende de múltiples factores, incluido el volumen del biorreactor, la productividad biológica, el volumen de la solución de extracción, el área de la membrana de fibra hueca y las tasas de recirculación de líquidos dentro del sistema LLE. Durante un ciclo por lotes, la solución de decapado puede cambiar de color de transparente a marrón amarillento debido a la coextracción de bajo nivel de varios ácidos orgánicos pequeños (por ejemplo, ácido húmico, ácidos fúlvicos) presentes en el caldo de fermentación (Figura 3). Los resultados negativos de la extracción de AGCM están indicados por una acumulación lenta de productos de AGCM en la solución de extracción y concentraciones elevadas de AGCM en el caldo de fermentación en relación con la línea de base preestablecida. La productividad biológica del caproato es generalmente mayor que la del caprilato durante estos procesos de fermentación; Por lo tanto, es común que el caproato se acumule a un ritmo más rápido en la solución de extracción en comparación con el caprilato. Además, es normal que los AGCC, como el acetato y el butirato, se acumulen en la solución de extracción en cantidades más bajas, como se observa en la Figura 2. El TOPO en el aceite mineral tiene una mayor afinidad por los AGCM que por los AGCC, lo que provoca la eliminación selectiva de los AGCM. Los estudios de Saboe et al.12, Kaur et al.13, Carvajal-Arroyo et al.14 y Ge et al.11, demostraron la alta selectividad de TOPO para ácidos grasos en múltiples aplicaciones que involucran soluciones acuosas. En la Figura 4 se muestra la relación de partición de MCFA a SCFA durante el segundo ciclo de lotes. Se pueden esperar proporciones de partición MCFA:SCFA superiores a 40:1 varios días en un ciclo por lotes. La relación de partición MCFA:SCFA se estabilizará a medida que el proceso de extracción se acerque a un estado pseudo-estacionario. Si no se pueden alcanzar las proporciones >40 después de varios días, esto sugiere que el extractante TOPO se ha degradado o eluido. Si esto ocurre, se debe preparar una nueva solución de extracción (ver paso 1.1). Si la proporción disminuye después de la fase de meseta, esto sugiere que los AGCM se han acumulado más allá del 80% de su punto de saturación. Si esto ocurre, se debe preparar una nueva solución de pelado (ver paso 1.4) La baja eficiencia de extracción de MCFA puede deberse a caudales insuficientes dentro del sistema LLE. En la Figura 5, la velocidad de bombeo se redujo en la línea de circulación del caldo de fermentación y la solución de extracción para ilustrar el impacto de las tasas de recirculación de líquido disminuidas en la eficiencia de extracción de MCFA. La eficiencia de extracción se define como el porcentaje de AGCM extraído en la solución de extracción en relación con el total de AGCM producidos por el biorreactor más los AGCM extraídos por el LLE. Se puede esperar una eficiencia de extracción superior al 85% durante el funcionamiento normal (Figura 5, día 1-14). Cuando la velocidad de la bomba es baja (Figura 5, día 14), la eficiencia de extracción disminuye en respuesta. Cuando se restablece una velocidad de bombeo adecuada, pueden pasar varios días antes de que se recupere la eficiencia de la extracción. Esto podría deberse a una reducción en la concentración de MCFA en estado estacionario en la solución de extracción causada por la diferencia en las tasas de extracción de la solución de extracción (más alta) que del caldo de fermentación (más baja). Varios otros factores pueden contribuir a la disminución de la eficiencia de extracción, incluyendo (1) ensuciamiento de la membrana, (2) flujo de fluido restringido en cada etapa del sistema LLE debido a bloqueos, (3) la formación de bolsas de gas en los contactores de membrana y (4) permitir que las concentraciones de MCFA en la solución de extracción se acerquen a sus puntos de saturación. El ensuciamiento de la membrana se indica por una reducción del flujo de la membrana a lo largo del tiempo en relación con las condiciones iniciales. Si bien la formación de biopelículas es poco probable en el FEM, puede ocurrir ensuciamiento debido a la acumulación de desechos celulares y otros sólidos en suspensión. Además, mientras el BEM es aséptico, el flujo puede obstruirse debido a la precipitación de sales de ácidos grasos dentro del contactor de membrana o la tubería con el tiempo. Sin embargo, el mantenimiento y la limpieza rutinarios de los contactores de membrana (consulte el paso 2.6) deberían evitar que se desarrollen problemas de ensuciamiento y precipitación de sal. A veces se forman bolsas de gas en el lado de la carcasa superior de los contactores de membrana debido a un posicionamiento incorrecto. Los contactores de membrana deben estar ligeramente inclinados desde la vertical para garantizar que el puerto de salida del lado de la carcasa esté en el punto más alto, permitiendo que cualquier gas que se forme escape del contactor. El flujo de fluido en el sistema LLE está configurado para fluir desde la parte inferior hasta la parte superior de los contratistas para ayudar a eliminar las bolsas de gas. Por último, la transferencia de AGCM de la solución de extracción a la solución de extracción en el BEM disminuye a concentraciones muy altas de AGCM en la solución de extracción. Este problema se puede remediar reemplazando la solución de pelado con más frecuencia. Figura 1: Descripción general del sistema de extracción líquido-líquido. Una representación esquemática que muestra los componentes principales del sistema, los diversos circuitos de fluidos y las direcciones de flujo. Los componentes principales del sistema están etiquetados de la siguiente manera: (A) depósito de solución de extracción en fase orgánica, (B) membrana de intercambio directo, (C) membrana de intercambio regresivo, (D) bomba de diafragma de solución de extracción, (E) depósito de solución de extracción en fase acuosa, (F) sistema de control de pH, (G) puerto de salida del biorreactor, (H) puerto de flujo de retorno del biorreactor, (I) bomba peristáltica de membrana de intercambio directo y filtro de membrana de fibra hueca, (J) filtro de membrana de fibra hueca, (K) manómetro, (L) válvula de aguja y (M) bomba peristáltica de solución de extracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Acumulación de ácidos grasos en la solución de extracción. Datos que muestran las concentraciones de ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena media durante tres ciclos de lote de la solución de extracción durante la operación continua de extracción líquido-líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Cambio de color de la solución de extracción después de la extracción. Una fotografía que muestra el cambio de color de la solución de extracción en fase acuosa antes (es decir, antes del lote) y después (es decir, después del lote) de un ciclo de lote. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Proporciones de ácidos grasos en la solución de extracción. Datos que muestran la proporción de ácidos grasos de cadena media y ácidos grasos de cadena corta durante un ciclo por lotes de la solución de extracción durante la operación continua de extracción líquido-líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Efecto de los caudales de membrana en la eficiencia de extracción. Datos que muestran el efecto de caudales insuficientes a través de la membrana de intercambio hacia adelante y hacia atrás en la eficiencia de extracción de ácidos grasos de cadena media durante la operación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los AGCM producidos biológicamente se encuentran comúnmente en mezclas junto con varios compuestos orgánicos, incluidos los AGCC y los alcoholes2. En consecuencia, es necesario un proceso de separación selectiva para recuperarlos y utilizarlos de manera efectiva. El sistema LLE desarrollado aquí extrae selectivamente los AGCM de estas mezclas de forma continua, conservando los AGCC y los alcoholes. Esta funcionalidad hace que el sistema LLE sea especialmente adecuado para aplicaciones de fermentación, como la elongación de la cadena microbiana, donde los MCFA, SCFA y alcoholes constituyen los metabolitos primarios8. En concreto, el sistema LLE permite que el proceso de elongación de la cadena proceda mediante la eliminación de los AGCM, evitando la inhibición del producto1, al tiempo que deja los AGCC y los reactivos alcohólicos en el caldo de fermentación para su posterior conversión biológica. El sistema LLE se puede personalizar para otras aplicaciones modificando la solución de extracción específica. Por ejemplo, la extracción continua de AGCC producidos durante la fermentación podría lograrse utilizando el mismo sistema LLE eliminando el TOPO de la mezcla de la solución extractiva.

Por lo tanto, la importancia del método LLE radica en proporcionar una técnica de extracción de AGCM más robusta para estas aplicaciones de bioprocesamiento y biotecnología en comparación con otros métodos. La extracción bifásica in situ con líquidos no miscibles es otro enfoque para la extracción de AGCM del caldo de fermentación15. Sin embargo, este enfoque es relativamente ineficiente. Las capas de emulsión se forman entre la fase acuosa (es decir, el caldo de fermentación) y la fase orgánica, lo que limita severamente las tasas de transferencia de masa. La mínima mezcla de fluido interfacial entre las capas de fase también limita la transferencia de masa. Otra desventaja es que las células microbianas están en contacto directo con la fase orgánica, causando arrastre, inhibición y muerte celular15. Por último, la extracción bifásica in situ requiere un mantenimiento frecuente para eliminar y sustituir la fase orgánica.

La aplicación de altas tasas de dilución dentro del biorreactor es otro método para evitar la inhibición del producto16. Las altas tasas de dilución pueden lograr una alta productividad al mantener altas concentraciones de reactivos en el biorreactor. Sin embargo, este enfoque es desventajoso porque contribuye al lavado de la biomasa, a la generación de grandes volúmenes de efluentes y a las grandes pérdidas de sustrato (es decir, AGCC y alcoholes), lo que da lugar a bajos rendimientos. Estas desventajas pueden mitigarse mediante el uso de biomasa inmovilizada y el reciclaje de efluentes, pero estas intervenciones aumentan la complejidad del sistema17. Finalmente, la concentración de MCFA en el flujo de producto está diluida, lo que hace que MCFA sea ineficiente y costoso.

Un nuevo enfoque de extracción podría implicar la destilación continua de los AGCM con una sola membrana de extracción directa que separa físicamente las fases orgánica y acuosa, reteniendo y protegiendo así la biomasa microbiana. Los AGCM se extraerían selectivamente en la fase orgánica y luego se destilarían. El refinado podría reciclarse continuamente en la membrana de extracción. Sin embargo, la destilación continua es técnicamente desafiante, especialmente en entornos de laboratorio, y puede causar el deterioro o la pérdida del extractor químico durante el funcionamiento a largo plazo. La destilación también puede causar la degradación térmica de la fase orgánica y de los productos MCFA18.

El proceso LLE evita muchas de las desventajas asociadas con estos enfoques alternativos al incorporar varias características críticas y pasos de procesamiento. En primer lugar, el filtro de membrana hidrofílico de fibra hueca cumple el doble propósito de proteger las células de biomasa (los biocatalizadores) de la exposición a la solución extractiva en el FEB, al tiempo que proporciona un filtrado claro rico en MCFA que reduce el ensuciamiento y la acumulación de sólidos en el sistema LLE. En segundo lugar, para evitar el cruce de líquidos, incorporamos válvulas de aguja para crear contrapresión en el lado del tubo de cada contactor de membrana. Esta precaución mantiene un ligero gradiente de presión transmembrana, evitando fugas indeseables del solvente orgánico hidrofóbico desde el lado de la carcasa hasta el lado del tubo acuoso en el FEM y BEM. Además, las corrientes de líquido están configuradas para fluir en paralelo desde la base hasta la parte superior del FEM y BEM para evitar el atrapamiento de burbujas de gas que podrían acumularse dentro de los módulos de membrana, reduciendo la eficiencia de transferencia y causando arrastre. Además, este método utiliza una bomba de diafragma con un cabezal de bomba de PTFE químicamente resistente para bombear la solución extractiva corrosiva que contiene MCFA, salvaguardando el sistema de la corrosión y las averías que podrían comprometer el proceso de extracción. Por último, la solución de stripping alcalino con pH controlado mantiene un gradiente de pH que permite la transferencia continua de MCFA a través del sistema LLE a altas tasas desde el biorreactor hasta el depósito de la solución de stripping, donde los MCFA se desprotonan y se acumulan a títulos altos, lo que facilita la recuperación del producto aguas abajo.

Este método LLE es apropiado para la extracción continua de AGCM de biorreactores a escala de laboratorio (hasta un volumen de trabajo de 6 L) y ha sido validado para su operación a largo plazo en varios estudios 1,9,11,19. El método LLE también se puede aplicar para aplicaciones a mayor escala14 (es decir, biorreactores a escala piloto), pero requiere membranas y equipos de manejo de fluidos a escala proporcional. Sin embargo, el método tiene algunas limitaciones, principalmente en el área de mantenimiento y complejidad del sistema. Debido a que el proceso está diseñado para funcionar continuamente, los módulos de membrana y las bombas deben ser revisados con frecuencia, lo que resulta en tiempos de inactividad considerables. Otro inconveniente es que la solución de extracción requiere cantidades relativamente grandes de NaOH y ácido bórico. Además, los MCFA son corrosivos y hacen que ciertos componentes del sistema LLE se deterioren con el tiempo. Por ejemplo, los conectores de plástico y la carcasa de la membrana pueden volverse frágiles y requerir su reemplazo durante el funcionamiento. Por último, la red de manejo de fluidos en el sistema LLE es compleja e involucra muchos puntos de conexión que pueden desarrollar fugas. Sin embargo, la mayoría de estas limitaciones e inconvenientes son típicas de los procesos continuos de separación de membranas y deben esperarse.

En general, este protocolo LLE ofrece un enfoque sólido y eficiente para la extracción selectiva de AGCM, lo que tiene implicaciones para el avance de la investigación en diversos campos. El método podría encontrar muchas aplicaciones relevantes en el campo de la fermentación de precisión para la recuperación in situ de productos de metabolitos extracelulares durante la fermentación. El LLE podría ser una alternativa de menor coste a los enfoques convencionales de procesamiento posterior (DSP), como la centrifugación posterior a la ejecución, la microfiltración y la ultrafiltración o las extracciones con disolventes realizadas en lotes. De hecho, el DSP a menudo representa un importante factor de coste en los procesos de fermentación industrial. La extracción continua de productos mediante LLE también puede permitir fermentaciones continuas, lo que mejora drásticamente la productividad de las operaciones y la eficiencia del tiempo de ejecución en comparación con los enfoques convencionales de lotes o lotes alimentados. Además, las investigaciones futuras podrían investigar medios de extracción distintos de los disolventes orgánicos, como los disolventes eutécticos profundos o los líquidos iónicos. Por último, el sistema LLE descrito en este protocolo estaba destinado a fines experimentales en un entorno de laboratorio; Por lo tanto, todavía hay un espacio considerable para los estudios de optimización para reducir los requisitos de energía, el área de la membrana y los rendimientos y tasas generales de extracción.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer el apoyo técnico y financiero brindado por la Estación Experimental Agrícola de la Universidad de Georgia. Además, los autores quieren agradecer a Samuel Ogundipe, al Dr. Ronald Pegg y al Dr. Joon Hyuk Suh por su ayuda en el análisis de muestras de proceso.

Materials

10 L Media Bottle Duran 218018658
3.5 L Media Bottle Duran 218016957
Boric acid, 99.5%,  ThermoScientific (Fisher Scientific) 327132500
Hydrophilic MINIKROS 20CM 0.2UM PES 1MM 1.5TC X 3/4TC Repligen N02-P20U-10-N
L/S Variable-Speed Pump Drive; 100 rpm MasterFlex (VWR) MFLX07528-10
L/S Variable-Speed Pump Drive; 300 rpm MasterFlex (VWR) MFLX07528-20
Light Mineral Oil, NF (4 Liters) (CAS: 8042-47-5) Thomas Scientific C761Z18
Liqui-Cel 2.5×8 X50 membrane CO2, PP Housing Viton O-rings (0.5-3 gpm (0.1-0.7 m3/h)), 1/4-in FNPT connections 3M LC-02508X50-G453
Magnetic Stirrer, 20 L Capacity, 110 V Cole-Parmer EW-04661-29
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 14 MasterFlex (VWR) MFLX06402-14 Specific tubing size will depend on application.
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 16 MasterFlex (VWR) MFLX06402-16 Specific tubing size will depend on application.
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 17 MasterFlex (VWR) MFLX06402-17 Specific tubing size will depend on application.
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 18 MasterFlex (VWR) MFLX06402-18 Specific tubing size will depend on application.
MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 14, Polycarbonate Housing, CRS Rotor MasterFlex (VWR) MFLX07014-20 Specific pump head size will depend on application.
MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 14, Polycarbonate Housing, CRS Rotor MasterFlex (VWR) MFLX07014-20 Specific pump head size will depend on application.
MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 16, Polycarbonate Housing, CRS Rotor MasterFlex (VWR) MFLX07016-20 Specific pump head size will depend on application.
MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 17, Polycarbonate Housing, CRS Rotor MasterFlex (VWR) MFLX07017-20 Specific pump head size will depend on application.
MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 18, Polycarbonate Housing, CRS Rotor MasterFlex (VWR) MFLX07018-20 Specific pump head size will depend on application.
MasterFlex PTFE-diaphragm pump head, 10 to 100 mL/min MasterFlex (VWR) MFLX07090-62
Oakton 220 pH/ORP/Temperature Controller, 1/8 DIN Spectrum Laboratory Products 664-12595-E1
Oakton 220 pH/ORP/Temperature Controller, 1/8 DIN Spectrum Laboratory Products 664-12595-E1
Oakton Female BNC-to-Stripped Wire Adapter Spectrum Laboratory Products 664-12592-E1
pH Probe with BNC Connector ThermoScientific 10010-788 Any pH probe with a BNC connector will suffice. 
Precision Flow-Adjustment Valve, White Polypropylene, 1/4 NPT Male x Male McMaster-Carr 7792K57
ProConnex  Fittings Kits – A Repligen ACPX-KT2-01N Compatible with Hydrophilic MINIKROS Filter
ProConnex Fittings Kits – B Repligen ACPX-KT1-01N Compatible with Hydrophilic MINIKROS Filter
Sodium Hydroxide Pellets for Analysis Sigma Aldrich 1.06498
Stainless-Steel Pressure Gauge 0-60 psi Stainless Steel 1/4" NPT 2.5" Face Dial NA XJ-219 Any comparable pressure gauge covering 0-60 psig range will suffice. 
Trioctylphosphine oxide (TOPO)  Sigma-Aldrich 346187-100G
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Taiwo, K. J., Nguyen, H., Usack, J. G. Continuous Liquid-Liquid Extraction of Medium-Chain Fatty Acids from Fermentation Broth Using Hollow-Fiber Membranes. J. Vis. Exp. (210), e66956, doi:10.3791/66956 (2024).
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