펩타이드를 이용한 생쥐 폐의 희귀 항원 특이적 T 세포 식별: 주요 조직적합성 복합체 테트라머
Summary
자사는 자기 비드 기반 T 세포 농축 및 펩타이드:주요 조직 적합성 복합체(MHC) 사량체를 통해 쥐 폐에서 희귀 항원 특이적 T 세포 집단을 분리하고 식별하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
건강 및 질병 중 항원 특이적 T 세포의 식별 및 특성 분석은 면역 병태 생리학에 대한 이해를 향상시키는 열쇠로 남아 있습니다. 내인성 T 세포 레퍼토리 내에서 항원 특이적 T 세포 집단을 추적하는 기술적 과제는 펩타이드:MHC 테트라머 시약의 개발로 크게 발전했습니다. 항원 펩타이드 에피토프에 복합된 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자의 이러한 형광 표지된 용해성 멀티머는 해당 T 세포 수용체(TCR) 특이성을 가진 T 세포에 직접 결합하므로 생체 외(ex vivo )에 의해 유도된 기능 반응 없이 원래 상태의 항원 특이적 T 세포 집단을 식별할 수 있습니다 자극. 극히 드문 집단의 경우, tetramer-bound T cell을 자기적으로 강화하여 검출의 민감도와 신뢰성을 높일 수 있습니다.
조직에 상주하는 T 세포 면역에 대한 연구가 심화됨에 따라 비림프 조직으로 이동하고 상주하는 항원 특이적 T 세포를 식별해야 할 필요성이 시급합니다. 이 프로토콜에서는 마우스 폐 내에 존재하는 항원 특이적 T 세포의 분리 및 특성 분석을 위한 자세한 지침을 제시합니다. 여기에는 소화된 폐 조직에서 T 세포를 분리한 후 일반 T 세포 자기 농축 단계와 유세포 분석 및 분류를 위한 테트라머 염색이 포함됩니다. 이 프로토콜에서 강조된 단계는 일반적인 기술과 쉽게 구할 수 있는 시약을 활용하여 마우스 T 세포 면역학에 종사하는 거의 모든 연구자가 이용할 수 있도록 하며, 폐 내에 상주하는 저주파 항원 특이적 T 세포 집단의 다양한 다운스트림 분석에 매우 적합합니다.
Introduction
적응 면역 체계의 핵심은 특정 항원을 인식하고 반응하는 T 세포의 능력입니다. T세포가 동족 항원에 반응하는 시기와 위치는 감염과 자가면역, 항상성과 암, 건강과 질병의 균형을 결정한다1. 따라서 면역의 특정 맥락에서 T 세포에 대한 연구는 관련 관심 항원에 대한 특이성을 가진 세포에 초점을 맞춰야 합니다. 항원 특이적 T 세포 집단을 특성화하는 능력을 크게 향상시킨 기술 발전 중에는 “펩타이드:MHC 사량체”로 더 잘 알려진 항원 펩타이드 에피토프에 복합된 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II 분자의 형광 표지된 용해성 멀티머(일반적으로 테트라머)가 있습니다2,3,4,5 . 펩타이드:MHC class I 및 class II tetramers는 T 세포 항원 수용체(TCR)의 천연 리간드를 나타내어 면역 체계에서 T 세포의 내인성 레퍼토리 내에서 항원 특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 각각 직접 식별할 수 있는 수단을 제공합니다. Tetramers는 TCR 형질전환 T 세포 채택전달 모델보다 항원 특이적 T 세포 연구에 대한 더 우아한 접근 방식을 나타내며6, 실험 마우스 모델과 인간 질병 모두에서 외부 및 자가 항원 특이적 T 세포 집단을 식별하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다 4,5.
테트라머는 항원 자극에 반응하여 증식한 고주파 T 세포 집단을 쉽게 식별할 수 있지만, 순진한 자기 항원 특이적 또는 기억 T 세포에 대한 사용은 이러한 집단의 매우 낮은 빈도로 인해 제한된다7. 우리 그룹과 다른 연구자들은 마우스 림프 조직에서 이러한 세포 집단을 연구할 수 있도록 검출 감도를 높이는 테트라머 기반 자기 농축 전략을 개발하고 대중화했습니다 8,9,10,11.
이 분야에서 조직에 상주하는 T 세포가 출현함에 따라 비림프 공간에서 T 세포를 조사하는 새로운 방법 개발에 대한 중요성이 높아졌습니다. 다른 많은 점막 표면과 마찬가지로 폐의 T 세포는 숙주 상피, 공생 및 감염성 미생물, 알레르겐을 포함한 환경 개체에서 유래한 다양한 자체 항원 및 외부 항원과 마주합니다. 비림프 조직(NLT)에서 채취한 T 세포의 전사 분석은 종종 밀매 및 조직 항상성을 대상으로 하는 고유한 조직 특이적 운명과 기능을 지닌 기억과 같은 표현형을 보여줍니다12. 더욱이, 조직에 상주하는 기억 T 세포(Trm)는 순환 중인 세포보다 클론이 더 제한되는 경향이 있다13. 항원이 NLT에서 T 세포 거주를 촉진하는 방법과 이유를 규명하는 것은 면역 체계가 감염으로부터 보호하고, 조직 항상성을 유지하며, 때로는 자가면역으로 전환되는 방법을 이해하는 데 중요합니다. 그러나, 다른 NLT14에 비해 폐의 조직에 상주하는 T 세포 사이에서 더 큰 감소가 있는 것으로 보인다. 따라서, 주어진 항원 특이성을 가진 폐의 내인성 T 세포를 식별하고 특성화하는 능력은 고유한 희귀성에 의해 제한됩니다.
마그네틱 비드 기반 세포 농축 기술과 펩타이드:MHC 테트라머 염색을 결합하여 마우스 폐에서 확장되었지만 희귀한 자기 항원 특이적 T 세포를 검출하는 데 성공했습니다15,16. 여기에서는 쥐의 폐에 존재하는 모든 희귀 항원 특이적 T 세포 집단을 신뢰성 있게 분리하고 특성화하기 위해 최적화한 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다(그림 1). 이 프로토콜은 조직 상주하는 혈관 T 세포를 구별하기 위한 생체 내 항체 염색 단계를 통합하고(17) 자원 가용성을 수용하기 위해 폐 조직 처리를 위한 두 가지 다른 방법을 따릅니다. 그런 다음 일반 T 세포 자기 농축 단계, tetramer 염색 및 유세포 분석을 수행합니다. 이 프로토콜에서는 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 매개 T 세포 활성화 유도 세포사멸18을 차단하는 아미노구아니딘과 TCR 하향 조절19를 제한하는 다사티닙을 추가함으로써 세포 생존도 및 테트라머 염색이 더욱 향상됩니다. 이 프로토콜에서 강조된 단계는 일반적인 기술과 쉽게 구할 수 있는 시약을 활용하므로 마우스 T 세포 면역학에 종사하는 거의 모든 연구자가 이용할 수 있으며 다양한 다운스트림 분석에 매우 적합합니다. 미성숙 T 세포가 폐에서 발견될 가능성은 낮지만, 이 프로토콜은 폐의 자기 항원 특이적 T 세포 및 Trms 연구에 특히 도움이 될 것이라고 믿습니다.
그림 1: 프로토콜 워크플로우 개요. 쥐에서 폐를 채취하여 단일 세포로 해리합니다. 이후 펩타이드:MHC tetramers 및 유세포 분석을 위한 형광 표지 항체로 염색하기 전에 T 세포에 대해 샘플을 농축합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
폐에서 채취한 항원 특이적 T 세포의 이전 특성 분석은 비강 내 면역 또는 감염과 같은 급성 프라이밍 사건 후에 증식하는 항원 특이적 T 세포의 강력한 수로부터 이익을 얻었습니다 20,21,22. 그러나, 자기 항원 특이적 T 세포 또는 조직 상주 기억 T 세포와 같은 폐 내의 더 드문 T 세포 집단은 관심 T 세포에 대한 어떤 형태의 샘플 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
조직 가공 및 테트라머 생산에 대한 기술 지원을 제공한 L. Kuhn에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R01 AI107020 및 P0 AI165072 1은 J.J.M., T32 AI007512는 D.S.S.), 매사추세츠 병원체 준비 컨소시엄(Massachusetts Consortium on Pathogen Readiness, J.J.M) 및 매사추세츠 종합병원 연구 집행 위원회(Massachusetts General Hospital Executive Committee on Research)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 100 mm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 10x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 46-013-CM | |
| 1x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 21-031-CV | |
| AccuCheck Counting Beads | Invitrogen | PCB100 | |
| Aminoguanidine Hemisulfate Salt | Sigma-Aldrich | A7009 | |
| CD90.2 microbeads, mouse | Miltenyi | 130-121-278 | |
| Cell separation magnet (MidiMACS Separator) | Miltenyi | 130-042-302 | Holds single LS column |
| Cell separation magnet (QuadroMACS Separator) | Miltenyi | 130-090-976 | Holds 4 LS columns |
| Dasatinib | Sigma-Aldrich | CDS023389 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Eagle’s Ham’s Amino Acids medium | Sigma-Aldrich | C5572 | |
| gentleMACS | Miltenyi | 130-093-235 | Automated tissue dissociator |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | Automated tissue dissociator tubes |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++ | Corning | 21-020-CM | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Ketamine | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103126 | |
| Paramagnetic cell separation columns (LS Columns) | Miltenyi | 130-042-401 | Comes with plunger |
| Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93) | Biolegend | 101302 | |
| RPMI 1640 medium without L-glutamine | Corning | 15-040-CM | |
| Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline) | Cytiva | Z1376 | |
| Xylazine | Pivetal | NDC 466066-750-02 |
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