Minipiglerde Tek Aşamalı Doku Mühendisliği Ürotelyal Tüpler için Cerrahi Model

Bu deney, hayvan deneklerin laboratuvar kullanımına ilişkin Avrupa mevzuatına uygun olarak ve Danimarka Gıda ve Tarım Bakanlığı tarafından verilen etik izin alındıktan sonra AAALAC tarafından akredite edilmiş bir deney tesisinde gerçekleştirilmiştir (Ref. no. 2022-15-0201-01206). 1. Cerrahi prosedür Hayvan hazırlamaDişi bir yetişkin Göttingen minipigini ameliyat öncesi en az 12 saat hızlı tutun. Ameliyat masasını tüm steril kaplarla birlikte aşağıda anlatıldığı gibi hazırlayın. Tam büyümüş standart boyutlu minipigler için, hayvanı 1.25 mL ketamin (100 mg / mL), 6.25 mL ksilazin (20 mg / mL), 1.25 mL metadon (10 mg / mL) ve 2 mL butorphanol (10 mg / mL) (daha sonra sedasyon karışımı olarak anılacaktır) içinde süspanse edilmiş 125 mg zolazepam ve 125 mg tiletamin çözeltisi ile 1.0-1.4 mL / 10 kg ile intramüsküler enjeksiyon ile sedasyon ile sedasyon yapın. Görsel kılavuzluğunda endotrakeal entübasyon gerçekleştirin. Anesteziyi yaşamsal belirtiler ve göz ve interdigital refleks testi ile onaylayın. Oftalmik merhemi iki taraflı olarak uygulayın. Bilateral kulak damarı kateterleri takın ve propofol (10-15 mg/kg/saat) ve fentanil (5-15 mg/kg/saat) ile anesteziyi sürdürün. 8 Fr’lik bir idrar sondası yerleştirin ve uygun boyutta bir luer kilit şırıngası kullanarak mesaneyi 250 mL fizyolojik olarak ılıman izotonik salin ile doldurun. Domuzu sırtüstü pozisyona getirin, ardından karnınızı yerle bir edin ve ovalayın. % 70 etanol ile iki tur daha cilt temizliğinden sonra, cerrahi alanı steril örtü ile çerçeveleyin. Doku toplama ve cerrahi iskele implantasyonuNeşter ve koter ile standart bir alt orta hat laparotomisi yapın, cildi, kası ve peritonu ayırın ve intraperitoneal idrar kesesini yaraya çekin. Ön mesane duvarında profilaktik hemostaz yapın ve kalan mesane duvarını hızlı emilebilir örgülü bir koşu ipliği ile kapatırken 1cm2’lik bir proksimal açıklık bırakarak2 cm2’lik bir tam duvar segmentini çıkarın. Rezeke edilen örneğin mukozal tabakasını dikkatlice inceleyin ve iskele gömmek için 2cm2’lik bir mukozal örneği 1 mm2 mikrogreftlere kıyın (aşağıda bölüm 2’de açıklanmıştır). İskeleyi tamamladıktan sonra, boru şeklindeki yapıyı yavaş emilebilir monofilament çalışan bir sütür ile ön mesane duvarında kalan açıklığa anastomoz edin. Boru şeklindeki iskeleyi yamalamak için pubovezikal ligamentten bir peritoneal flep kullanın ve boru şeklindeki iskeleye bir intraluminal 14 Fr antegrad kolon lavmanı (ACE) tıpası yerleştirin. İdrarın dışarı sızmasını önlemek için kanalın distal ucunu yavaş emilebilir 4-0 monofilament sütür ile bağlayın ve anastomoz açıklığını doğrulamak için mesane kateteri yoluyla şırıngalarla toplam 250 mL steril salin enjekte edin. Transfasyal bir kanalı orta hatta lateral, sağ taraftaki kaudal meme bezine 2-3 cm kaudal olarak künt bir şekilde inceleyin ve kanalı deri altı bir cebe yerleştirin. Konumu cilt seviyesinde işaretlemek için distal kanalı iki transkutan, emilemeyen monofilament sütürle sabitleyin. Karın kasının ön kas fasyasını yavaş emilebilir monofilament koşu sütürü ile kapatın, subkutisi hızlı emilebilir örgülü koşu sütürü ile uyarlayın ve cildi emilmeyen monofilament koşu sütürü ile kapatın. Anesteziyi bıraktıktan sonra, hayvanı ekstübe edin ve tamamen yürüyene ve güvenli bir şekilde içip yiyebilecek duruma gelene kadar ahırlarda gözlemleyin. 2. İskele yapımı Kompozit iskelenin hazırlanmasıAmeliyattan önce (en fazla 2 saat), daha önce tarif edildiği gibi sıvı bir sıçan kuyruğu kollajen tip I çözeltisi hazırlayın17. Kısacası, kollajen çözeltisine 10x minimum esansiyel ortamın (MEM) 4: 1’ini ekleyin ve pH’ı 1 M NaOH ile 7.4’e yaklaştırın ve son olarak 1.64 mg / mL’lik bir nihai kollajen konsantrasyonunu hedefleyerek 1x MEM ekleyin. Solüsyonu daha fazla kullanılana kadar buz üzerinde steril bir şişede saklayın. Cerrahi doku rezeksiyonu ve kıyma işleminden sonra, mukozal parçacıkları (yani mikrogreftleri) 1: 6 genişleme oranına sahip 2 cm x 6 cm’lik biyolojik olarak parçalanabilen bir ağa manuel olarak yerleştirin (ör., 2cm2’lik bir mukozal doku 12cm2’lik bir ağa genişletilir) forseps kullanarak. Steril bir çelik plakanın üzerine 1 cm x 3 cm x 6 cm (yükseklik x genişlik x uzunluk) ölçülerinde steril bir dikdörtgen çelik kalıp hazırlayın ve ağı, mikrogreftler yukarı bakacak şekilde çelik kalıba yerleştirin. 20 mL kollajen solüsyonunu kalıba nazikçe dökün ve mikrogreftleri ağdan atmamaya dikkat edin. Tüm yapıyı 38 °C steril bir ısıtma odasına aktarın ve beş dakika katılaşmaya bırakın. Yeterli katılaşmadan sonra, hidrojeli delikli bir çelik plaka üzerinde duran naylon bir ağ üzerine kaydırın ve kalıbı yavaşça çıkarın. Jelenin üzerine bir naylon ağ ve ardından çelik bir plaka yerleştirerek hidrojelden suyu dışarı atın ve ardından çelik plakanın üzerine yerleştirilmiş 120 g ağırlıkla (bu durumda gömme için kullanılan çelik kalıba eşdeğer) 5 dakika boyunca pasif olarak sıkıştırın. Kompresyondan sonra, düzleştirilmiş iskeleyi biyolojik olarak parçalanabilen bir stent etrafına, mikrogreftler stentin karşısına bakacak şekilde, 5 cm x 0,6 cm (uzunluk x iç çap) ölçülerinde yuvarlayın ve iskeleyi yavaş emilebilir monofilament çalışan bir sütür ile uzunlamasına yerine dikin. Tamamlanan kanal artık cerrahi implantasyon için hazırdır. 3. Ameliyat sonrası yönetim Analjezi ve antibiyotik profilaksisiİlk 3 gün buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg / 8 saat intravenöz olarak), ilk 4 gün boyunca meloksikam (0.4 mg / kg / gün intramüsküler veya oral olarak) ve trimetoprim (2.7 mg / kg / gün intramüsküler veya 4.2 mg / kg / gün oral) ve sülfadoksin (13.3 mg / kg / gün intramüsküler veya 20.8 mg / kg / gün oral) uygulayın. Kas içi enjeksiyonları, hayvan hala anestezi altındayken ameliyat sonrası uygulayın. Dış ven kateterlerinin ve dikiş materyalinin kemirilmesini önlemek için hayvanları tek başına barındırın. Pleksiglas pencerelerden komşu minipiglerle görsel temas ve kalemler arasında burun teması olasılığı sağlayın. Günlük taze saman ve saman ile oyuncaklar ve su temini ad libitum sağlayın ve günde iki kez besleyin. Hayvanları doğal davranış, yeme alışkanlıkları, idrar ve dışkı üretimi açısından günlük olarak izleyin ve vücut ağırlığını haftalık olarak değerlendirin. Gözlem süresinin sonunda (6 hafta), hayvanları 1-1.4 mL / 10 kg intramüsküler sedasyon karışımı enjeksiyonu ile sedasyon yapın ve hayvanı öldürücü bir pentobarbital enjeksiyon (intravenöz olarak 100 mg / kg) ile sonlandırın. 4. Ölüm sonrası değerlendirmeler Kaba anatomiSonlandırmadan sonra, distal kanalı cilt seviyesinde inceleyin ve ACE durdurucusunu çıkarın. Üretrayı plastik bir kelepçe ile kapatın ve bir kateter kullanarak distal kanal açıklığı yoluyla izotonik salin içinde 250 mL 1:20 kontrast iohexol solüsyonu enjekte edin. Hayvanı 64 kesitli bilgisayarlı tomografi tarayıcısı ile değerlendirin. Çok düzlemli rekonstrüksiyon kullanarak görüntüleri görselleştirin ve tıbbi görüntü işleme yazılımını kullanarak tüm görüntüleri analiz edin. Doğal üretra yoluyla 16.2 Fr esnek sistoskop ile mesane ve kanal lüminesinin endoskopik muayenesini yapın. Herhangi bir brüt anatomik bulguyu dikkatlice değerlendirirken kanalı blok halinde inceleyin. Ek olarak, tam duvar mesane biyopsilerini kanal anastomozuna 2 cm mesafeyle rezeke edin ve referans değerler için benzer şekilde işlem yapın. Histolojik işlemeEksize edilen numuneyi 24 saat boyunca% 10 formalin içinde sabitleyin. Kanalı bir neşter ile ortogonal olarak proksimal, medial ve distal kanal segmentlerinin eşit büyüklükte ayrı bölümlerine bölün. Numuneleri artan etanol konsantrasyonları ile kurutun ve mikrotom kesitinden önce parafine gömün. Hematoksilen ve eozin (H & E) ve pansitokeratin CK-AE ile 5 μm’lik kesitleri boyayın ve dijital histoloji slayt tarayıcı ile tarayın.