Chirurgisch model voor enkelfasige weefsel-gemanipuleerde urotheelbuizen bij minipigs

Dit experiment werd uitgevoerd in een door AAALAC geaccrediteerde experimentele faciliteit in overeenstemming met de Europese wetgeving inzake laboratoriumgebruik van proefdieren en na ethische toestemming verleend door het Deense ministerie van Voedsel en Landbouw (ref. nr. 2022-15-0201-01206). 1. Chirurgische ingreep Voorbereiding van dierenBind een vrouwelijk volgroeid Göttingen minivarken minimaal 12 uur preoperatief. Bereid de operatietafel voor met alle steriele gebruiksvoorwerpen zoals hieronder beschreven. Voor volgroeide minivarkens van standaardformaat, verdooft u het dier door middel van intramusculaire injectie met 1,0-1,4 ml/10 kg met een oplossing van 125 mg zolazepam en 125 mg tiletamine gesuspendeerd in 1,25 ml ketamine (100 mg/ml), 6,25 ml xylazine (20 mg/ml), 1,25 ml methadon (10 mg/ml) en 2 ml butorfanol (10 mg/ml) (later sedatiemengsel genoemd). Voer visueel geleide endotracheale intubatie uit. Bevestig anesthesie door vitale functies en oog- en interdigitale reflextesten. Oogheelkundige zalf bilateraal aanbrengen. Installeer bilaterale ooraderkatheters en ondersteun anesthesie met propofol (10-15 mg/kg/uur) en fentanyl (5-15 mg/kg/uur). Breng een 8 Fr urinekatheter in en vul de blaas met 250 ml fysiologisch gematigde isotone zoutoplossing met behulp van een luer lock-spuit van de juiste grootte. Leg het varken in rugligging, ras en schrob de buik. Na nog twee rondes van huidreiniging met 70% ethanol, omlijst u het operatieveld met steriele drapering. Weefseloogst en implantatie van chirurgische steigersVoer een standaard laparotomie van de onderste middellijn uit met scalpel en cauterisatie, waarbij de huid, spieren en buikvlies worden verdeeld en trek de intraperitoneale urineblaas naar de wond. Voer profylactische hemostase uit op de voorste blaaswand en snijd een volledig wandsegment van 2cm2 weg, waarbij u een proximale opening van 1cm2 overlaat terwijl u de resterende blaaswand sluit met een snel resorbeerbare gevlochten lopende hechtdraad. Ontleed voorzichtig de slijmvlieslaag van het gereseceerde monster en hak een slijmvliesmonster van 2cm2 in microtransplantaten van 1 mm2 voor het inbedden van de steiger (hieronder beschreven in sectie 2). Na voltooiing van de steiger, anastomoseert u de buisvormige constructie naar de resterende opening op de voorste blaaswand met een langzaam resorbeerbare monofilament lopende hechtdraad. Gebruik een peritoneale flap van het pubovesicale ligament om de buisvormige steiger te repareren en plaats een intraluminale 14 Fr antegrade colonklysma (ACE) stop in de buisvormige steiger. Bind het distale uiteinde van de leiding aan met een langzaam resorbeerbare 4-0 monofilamenthechting om te voorkomen dat urine weglekt, en injecteer in totaal 250 ml steriele zoutoplossing met spuiten via de blaaskatheter om de anastomose doorgankelijkheid te bevestigen. Ontleed botweg een transfasciaal kanaal lateraal van de middellijn, 2-3 cm caudaal ten opzichte van de caudale borstklier aan de rechterkant, en plaats de buis in een onderhuidse zak. Fixeer de distale buis met twee transcutane niet-resorbeerbare monofilamenthechtingen om de locatie op huidniveau te markeren. Sluit de voorste spierfascia van de buikspier met een langzaam resorbeerbare monofilament lopende hechtdraad, pas de onderhuidse aan met een snel resorbeerbare gevlochten lopende hechting en sluit de huid met een niet-resorbeerbare monofilament lopende hechtdraad. Na het staken van de anesthesie, extubeert u het dier en observeert u het in de stallen totdat het volledig ambulant is en veilig kan drinken en eten. 2. Steiger constructie Voorbereiding van de composiet steigerBereid voorafgaand aan de operatie (maximaal 2 uur) een vloeibare oplossing van rattenstaartcollageen type I zoals eerder beschreven17. Kortom, voeg 4:1 van 10x minimum essential medium (MEM) toe aan de collageenoplossing en benader de pH tot 7,4 met 1 M NaOH, en voeg ten slotte 1x MEM toe, met als doel een uiteindelijke collageenconcentratie van 1,64 mg/ml. Bewaar de oplossing in een steriele injectieflacon op ijs tot verder gebruik. Plaats na chirurgische weefselresectie en fijnhakken de slijmvliesdeeltjes (d.w.z. microtransplantaten) handmatig op een biologisch afbreekbaar gaas van 2 cm x 6 cm met een uitzettingssnelheid van 1:6 (bijv. een slijmvliesweefsel van 2 cm2 wordt uitgebreid tot een gaas van 12 cm2 ) met een pincet. Zet een steriele rechthoekige stalen mal van 1 cm x 3 cm x 6 cm (hoogte x breedte x lengte) op een steriele stalen plaat en plaats het gaas in de stalen mal met de micrografts naar boven gericht. Giet voorzichtig 20 ml van de collageenoplossing in de mal en zorg ervoor dat de micrografts niet van het gaas worden gespoeld. Breng het geheel over naar een steriele verwarmingskamer van 38 °C en laat vijf minuten stollen. Schuif de hydrogel na voldoende stolling op een nylon gaas dat op een geperforeerde stalen plaat rust en verwijder de mal voorzichtig. Verdrijf het water uit de hydrogel door een nylon gaas en vervolgens een stalen plaat op de gel te plaatsen en druk vervolgens passief samen met een gewicht van 120 g (in dit geval gelijk aan de stalen mal die wordt gebruikt voor het inbedden) dat gedurende 5 minuten op de stalen plaat wordt geplaatst. Rol de afgeplatte steiger na compressie rond een biologisch afbreekbare stent, micrografts gericht op de stent, van 5 cm x 0,6 cm (lengte x binnendiameter) en hecht de steiger in de lengterichting vast met een langzaam resorbeerbare monofilament lopende hechtdraad. De voltooide leiding is nu klaar voor chirurgische implantatie. 3. Postoperatieve behandeling Analgesie en antibioticaprofylaxeDien buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg/8 uur intraveneus) toe gedurende de eerste 3 dagen, meloxicam (0,4 mg/kg/dag intramusculair of oraal) gedurende de eerste 4 dagen, en trimethoprim (2,7 mg/kg/dag intramusculair of 4,2 mg/kg/dag oraal) en sulfadoxine (13,3 mg/kg/dag intramusculair of 20,8 mg/kg/dag oraal) gedurende de eerste 5 dagen. Dien de intramusculaire injecties postoperatief toe terwijl het dier nog onder narcose is. Huisvest de dieren in één huis om te voorkomen dat ze aan uitwendige aderkatheters en hechtmateriaal knabbelen. Zorg voor visueel contact met naburige minivarkens door plexiglas ramen en de mogelijkheid van snuitcontact tussen hokken. Zorg dagelijks voor vers stro en hooi, evenals speelgoed en watervoorziening ad libitum en voer tweemaal daags. Monitor de dieren dagelijks op natuurlijk gedrag, eetgewoonten, urine- en ontlastingsproductie en meet wekelijks het lichaamsgewicht. Aan het einde van de observatieperiode (6 weken) verdoezelt u de dieren met 1-1,4 ml/10 kg intramusculaire injectie van het sedatiemengsel en beëindigt u het dier met een dodelijke pentobarbital-injectie (100 mg/kg intraveneus). 4. Postmortem beoordelingen Grove anatomieOntleed na beëindiging de distale leiding ter hoogte van de huid en verwijder de ACE-stop. Sluit de urethra af met een plastic klem en injecteer 250 ml van een 1:20 contrastoplossing van iohexol in isotone zoutoplossing via de distale leidingopening met behulp van een katheter. Beoordeel het dier met een computertomografiescanner met 64 plakjes. Visualiseer afbeeldingen met behulp van multiplanaire reconstructie en analyseer alle afbeeldingen met behulp van medische beeldverwerkingssoftware. Voer een endoscopisch onderzoek uit van de blaas en de leiding lumina met een flexibele cystoscoop van 16,2 Fr via de natuurlijke urethra. Resectie de leiding en bloc terwijl u eventuele grove anatomische bevindingen zorgvuldig evalueert. Verwijder bovendien volwandige blaasbiopten met een marge van 2 cm ten opzichte van de conduitanastomose en verwerk op een vergelijkbare manier voor referentiewaarden. Histologische verwerkingFixeer het weggesneden monster gedurende 24 uur in 10% formaline. Verdeel de leiding orthogonaal met een scalpel in afzonderlijke secties van gelijke grootte van proximale, mediale en distale leidingsegmenten. Dehydrateer de monsters met toenemende ethanolconcentraties en veranker ze in paraffine voordat ze in microtoom worden gesneden. Kleuring van 5 μm coupes met hematoxyline en eosine (H&E) en pancytokeratine CK-AE en scan met een digitale histologieglaasjesscanner.