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Bioengineering

Modelo cirúrgico para tubos uroteliais de engenharia de tecido de estágio único em minipigs

Published: July 05, 2024
doi:
10.3791/66936
, , , , , ,
1Division of Pediatric Surgery, Department of Surgery and Transplantation,Copenhagen University Hospital – Rigshospitalet, 2Laboratory of Tissue Engineering, Department of Clinical Medicine,University of Copenhagen, 3Laboratory of Tissue Engineering, Department of Women’s and Children’s Health,Karolinska Institutet, 4Department of Experimental Medicine,University of Copenhagen

Summary

Os implantes de engenharia de tecidos para cirurgia reconstrutiva raramente progridem além dos ensaios pré-clínicos devido à laboriosa cultura ex vivo , que inclui componentes de andaimes complexos e caros. Aqui, apresentamos um procedimento de estágio único projetado para desvio urinário com um andaime tubular acessível à base de colágeno contendo microenxertos autólogos.

Abstract

As cirurgias reconstrutivas são frequentemente desafiadas pela falta de tecido de enxerto. No tratamento das malformações urogenitais, a solução convencional tem sido a coleta de tecido gastrointestinal para reconstrução não ortotópica devido à sua abundância para restabelecer a função normal no paciente. Os resultados clínicos após o rearranjo dos tecidos nativos dentro do corpo são frequentemente associados a morbidade significativa; Assim, a engenharia de tecidos possui um potencial específico dentro deste campo da cirurgia. Apesar dos avanços substanciais, os andaimes de engenharia de tecidos ainda não foram estabelecidos como uma alternativa válida de tratamento cirúrgico, principalmente devido aos requisitos caros e complexos de materiais, produção e implantação. Neste protocolo, apresentamos um andaime tubular à base de colágeno simples e acessível, incorporado com partículas de tecido autólogas específicas de órgãos, projetado como um canal para desvio urinário. O andaime é construído durante o procedimento cirúrgico primário, compreende materiais cirúrgicos comumente disponíveis e requer habilidades cirúrgicas convencionais. Em segundo lugar, o protocolo descreve um modelo animal projetado para avaliar os resultados in vivo de curto prazo pós-implantação, com a possibilidade de variações adicionais ao procedimento. Esta publicação tem como objetivo demonstrar o procedimento passo a passo, com especial atenção ao uso de tecido autólogo e forma tubular.

Introduction

Nas malformações urogenitais, a cirurgia reconstrutiva pode ser necessária para restaurar a anatomia funcional, muitas vezes por indicação vital 1,2. As abordagens cirúrgicas convencionais utilizaram tecidos nativos de outros sistemas de órgãos (como o trato gastrointestinal) para reconstruir os órgãos malformados ou ausentes; no entanto, muitas vezes com risco de complicações pós-operatórias graves 3,4. No caso de desvio urinário para pacientes com disfunção neurogênica da bexiga que necessitam de cateterismo de longa duração, o apêndice ou segmentos do intestino delgado readaptados são frequentemente usados para construir um conduto urinário 5,6. A engenharia de tecidos oferece um tecido de enxerto alternativo que pode ser adaptado para atender às características específicas do órgão, minimizando assim a morbidade pós-operatória para os pacientes 7,8. Enquanto andaimes de vários tipos podem ser implantados por conta própria, a celularização adicional do andaime, de preferência com células autólogas, demonstrou melhorar os resultados regenerativos após o implante 9,10,11,12,13,14. No entanto, os andaimes de engenharia de tecidos são frequentemente compostos de componentes complexos e caros e, em segundo lugar, os requisitos para cultura de células ex vivo e semeadura de andaimes são trabalhosos e intensivos em recursos. Esses fatores têm dificultado a tradução clínica de andaimes de engenharia de tecidos, apesar de várias décadas de pesquisa na área. Ao reduzir a complexidade, bem como os requisitos monetários e materialistas, os andaimes de engenharia de tecidos podem ser implementados na cirurgia moderna em larga escala, abordando procedimentos raros e mais comuns.

O colágeno já foi estabelecido como uma plataforma viável para a expansão celular e, além disso, atua como um bioadesivo favorável na fixação de células ou tecidos em um suporte para implante cirúrgico 15,16,17. A microenxertia autóloga perioperatória contorna a necessidade de cultura de células ex vivo, colhendo o tecido de interesse durante o procedimento primário e reimplantando-o diretamente. Ao picar o tecido ressecado em partículas menores, a área de superfície e o potencial de crescimento são aumentados, permitindo uma maior taxa de expansão noandaime 18. O andaime à base de colágeno não adere especificamente às reconstruções urogenitais, mas pode, teoricamente, ser aplicado a várias áreas de reconstrução de órgãos ocos.

Neste manuscrito, apresentamos um protocolo para a construção de um andaime tubular, combinando colágeno com microenxertos uroteliais autólogos embebidos, e um modelo minipig avaliando a viabilidade técnica e a segurança, bem como o desempenho regenerativo, do andaime in vivo. O modelo foi avaliado em 10 miniporcos fêmeas adultas usando o protocolo e o método aqui apresentados. A principal vantagem do andaime é a simplicidade da construção e o implante em estágio único, poupando o paciente de vários procedimentos cirúrgicos subsequentes. O procedimento pode ser realizado em ambientes cirúrgicos convencionais por pessoal cirúrgico regular e requer equipamentos e materiais padrão. O modelo animal permite um ambiente controlado para estudar a implantação enquanto o animal retorna prontamente ao comportamento normal, com a possibilidade adicional de implementar variações no andaime e no procedimento.

Protocol

Este experimento foi realizado em uma instalação experimental credenciada pela AAALAC de acordo com a legislação europeia sobre uso laboratorial de animais e após permissão ética concedida pelo Ministério da Alimentação e Agricultura dinamarquês (Ref. nº 2022-15-0201-01206). 1. Procedimento cirúrgico Preparação animalJejuar uma fêmea adulta de Göttingen minipig por pelo menos 12 h no pré-operatório. Prepare a mesa cirúrgica com todos os utensílios estéreis, conforme descrito abaixo. Para miniporcos adultos de tamanho padrão, sedar o animal por injeção intramuscular com 1,0-1,4 mL / 10 kg com uma solução de 125 mg de zolazepam e 125 mg de tiletamina suspensa em 1,25 mL de cetamina (100 mg / mL), 6,25 mL de xilazina (20 mg / mL), 1,25 mL de metadona (10 mg / mL) e 2 mL de butorfanol (10 mg / mL) (mais tarde referido como mistura de sedação). Realize a intubação endotraqueal guiada visualmente. Confirme a anestesia por sinais vitais e testes oculares e de reflexo interdigital. Aplique pomada oftálmica bilateralmente. Instale cateteres bilaterais das veias da orelha e mantenha a anestesia com propofol (10-15 mg/kg/h) e fentanil (5-15 mg/kg/h). Insira um cateter urinário de 8 Fr e encha a bexiga com 250 mL de solução salina isotônica fisiologicamente temperada usando uma seringa luer lock de tamanho apropriado. Coloque o porco em decúbito dorsal, depois raspe e esfregue o abdômen. Após mais duas rodadas de limpeza de pele com etanol a 70%, enquadre o campo cirúrgico com campos estéreis. Colheita de tecidos e implantação de andaimes cirúrgicosRealize uma laparotomia padrão da linha média inferior com bisturi e cautério, dividindo a pele, o músculo e o peritônio, e puxe a bexiga urinária intraperitoneal até a ferida. Realize hemostasia profilática na parede anterior da bexiga e excise um segmento de parede total de 2 cm2 , deixando uma abertura proximal de 1 cm2 enquanto fecha a parede da bexiga restante com uma sutura contínua trançada de reabsorção rápida. Dissecar cuidadosamente a camada mucosa da amostra ressecada e picar uma amostra mucosa de 2 cm2 em microenxertos de 1 mm2 para incorporação de andaimes (descritos abaixo na seção 2). Depois de completar o andaime, anastomose a construção tubular à abertura restante na parede anterior da bexiga com uma sutura contínua de monofilamento de reabsorção lenta. Use um retalho peritoneal do ligamento pubovesical para remendar o andaime tubular e coloque uma rolha intraluminal de enema colônico anterógrado (ECA) de 14 Fr no andaime tubular. Ligue a extremidade distal do conduto com uma sutura de monofilamento 4-0 de reabsorção lenta para evitar que a urina vaze e injete um total de 250 mL de solução salina estéril com seringas através do cateter vesical para confirmar a patência da anastomose. Disseque sem corte um canal transfascial lateralmente à linha média, 2-3 cm caudalmente à glândula mamária caudal no lado direito e coloque o conduto em uma bolsa subcutânea. Fixe o conduto distal com duas suturas transcutâneas de monofilamento não reabsorvíveis para marcar o local no nível da pele. Feche a fáscia muscular anterior do músculo abdominal com uma sutura contínua de monofilamento reabsorvível, adapte a subcutânea com uma sutura contínua trançada de reabsorção rápida e feche a pele com uma sutura contínua de monofilamento não reabsorvível. Após interromper a anestesia, extubar o animal e observá-lo nos estábulos até que esteja totalmente deambulante e capaz de beber e comer com segurança. 2. Construção de andaimes Preparação do andaime compostoAntes da cirurgia (máximo 2 h), prepare uma solução líquida de colágeno de cauda de rato tipo I, conforme descrito anteriormente17. Em resumo, adicione 4:1 de meio essencial mínimo de 10x (MEM) à solução de colágeno e aproxime o pH para 7,4 com 1 M NaOH e, finalmente, adicione 1x MEM, visando uma concentração final de colágeno de 1,64 mg/mL. Conservar a solução num frasco para injetáveis estéril com gelo até nova utilização. Após a ressecção e picagem do tecido cirúrgico, coloque manualmente as partículas mucosas (ou seja, microenxertos) em uma tela biodegradável ajustada de 2 cm x 6 cm com uma taxa de expansão de 1:6 (por exemplo, um tecido mucoso de 2 cm2 é expandido para uma tela de 12 cm2 ) usando uma pinça. Prepare um molde de aço retangular estéril medindo 1 cm x 3 cm x 6 cm (altura x largura x comprimento) em cima de uma placa de aço estéril e coloque a tela no molde de aço com os microenxertos voltados para cima. Despeje suavemente 20 mL da solução de colágeno no molde, certificando-se de não lavar os microenxertos da tela. Transferir toda a construção para uma câmara de aquecimento estéril a 38 °C e deixar solidificar durante cinco minutos. Após solidificação suficiente, deslize o hidrogel sobre uma malha de náilon apoiada em uma placa de aço perfurada e remova suavemente o molde. Expulse a água do hidrogel colocando uma malha de náilon e depois uma placa de aço em cima do gel e, em seguida, comprima passivamente com um peso de 120 g (neste caso equivalente ao molde de aço usado para incorporação) colocado em cima da placa de aço por 5 min. Após a compressão, enrole o andaime achatado em torno de um stent biodegradável, microenxertos voltados para o stent, medindo 5 cm x 0,6 cm (comprimento x diâmetro interno), e suture o andaime longitudinalmente com uma sutura contínua de monofilamento de reabsorção lenta. O conduíte concluído está agora pronto para implantação cirúrgica. 3. Manejo pós-operatório Analgesia e profilaxia antibióticaAdministre buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg/8 h por via intravenosa) nos primeiros 3 dias, meloxicam (0,4 mg/kg/dia por via intramuscular ou oral) nos primeiros 4 dias e trimetoprima (2,7 mg/kg/dia por via intramuscular ou 4,2 mg/kg/dia por via oral) e sulfadoxina (13,3 mg/kg/dia por via intramuscular ou 20,8 mg/kg/dia por via oral) nos primeiros 5 dias. Administre as injeções intramusculares no pós-operatório enquanto o animal ainda está anestesiado. Alojar os animais para evitar mordiscar cateteres de veias externas e material de sutura. Proporcionar contato visual com minipigs vizinhos através de janelas de plexiglass e a possibilidade de contato do focinho entre os currais. Forneça palha e feno frescos diariamente, bem como brinquedos e abastecimento de água ad libitum e ração duas vezes ao dia. Monitore os animais diariamente quanto ao comportamento natural, hábitos alimentares, produção de urina e fezes e avalie o peso corporal semanalmente. No final do período de observação (6 semanas), sedar os animais com uma injeção intramuscular de 1-1,4 ml/10 kg de mistura de sedação e terminar o animal com uma injeção letal de pentobarbital (100 mg/kg por via intravenosa). 4. Avaliações post mortem Anatomia macroscópicaApós a terminação, dissecar o conduto distal ao nível da pele e remover a rolha da ECA. Feche a uretra com uma pinça plástica e injete 250 mL de uma solução de contraste 1:20 de iohexol em solução salina isotônica através da abertura do conduto distal usando um cateter. Avalie o animal com um scanner de tomografia computadorizada de 64 cortes. Visualize imagens usando reconstrução multiplanar e analise todas as imagens usando software de processamento de imagens médicas. Realize um exame endoscópico da bexiga e do lúmen do conduíte com um cistoscópio flexível de 16.2 Fr através da uretra nativa. Ressecção o conduíte em bloco enquanto avalia cuidadosamente quaisquer achados anatômicos macroscópicos. Além disso, ressece biópsias de bexiga de parede total com uma margem de 2 cm para a anastomose do conduto e processe de maneira semelhante para valores de referência. Processamento histológicoFixar a amostra excisada em formol a 10% durante 24 h. Divida o conduíte ortogonalmente com um bisturi em seções separadas de tamanhos iguais de segmentos proximais, mediais e distais. Desidrate as amostras com concentrações crescentes de etanol e incorpore-as em parafina antes do seccionamento do micrótomo. Coloração de cortes de 5 μm com hematoxilina e eosina (H&E) e pancitoqueratina CK-AE e varredura com um scanner digital de lâminas histológicas.

Representative Results

Neste estudo, a expansão do tecido urotelial in vivo é alcançada em um andaime tubular à base de colágeno. Ao incorporar o andaime com partículas de tecido autólogas, colhidas e processadas no perioperatório, o procedimento permite o implante do andaime em estágio único sem a necessidade de tratamento imunossupressor concomitante no pós-operatório. O manuseio cirúrgico é possibilitado pelo reforço do andaime com tela biodegradável e stent (Figura 1). Após 6 semanas de observação, a avaliação do tecido macroscópico não revelou sinais de rejeição ou infecção do hospedeiro, e o arcabouço tubular apresenta-se pérvio e desobstruído (Figura 2). A partir das avaliações histológicas, observa-se um epitélio luminal estratificado de origem urotelial cobrindo a totalidade do andaime, e remanescentes dos biomateriais de reforço ainda são visíveis após 6 semanas (Figura 3). Figura 1: Construção e implantação de andaimes. O tecido da bexiga é dissecado no perioperatório (canto superior esquerdo). Os microenxertos de mucosa picados são expandidos em uma tela cirúrgica (meio superior) e incorporados em colágeno solidificado (canto superior direito). O colágeno foi comprimido para expelir a água e um stent é preparado (canto inferior esquerdo). O andaime é tubularizado ao redor do stent e uma rolha ACE é colocada dentro do stent (meio inferior). A bexiga é parcialmente fechada e a construção é finalmente incorporada à bexiga no local original da excisão do tecido (canto inferior direito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Avaliação macroscópica do andaime. Após 6 semanas, o animal é sacrificado e o andaime (seta) é dissecado ao nível da pele (canto superior esquerdo). A bexiga é preenchida com contraste (amarelo) e a tomografia computadorizada é realizada para avaliar o conduto (seta) quanto à permeabilidade e sinais de formação de estenose (canto superior direito). Uma cistoscopia é realizada através da uretra para avaliar a bexiga e a anastomose (seta) após 6 semanas (canto inferior esquerdo). O conduto é mais uma vez testado quanto à permeabilidade inserindo um cateter (seta) através da abertura externa e na bexiga (canto inferior direito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Avaliação microscópica do andaime. O conduto ressecado é fixado e cortes transversais ortogonais são realizados para avaliar o conduto no sentido proximal-distal. Após 6 semanas, o lúmen do conduto (1) é avaliado para confirmar a epitelização (topo ampliado). Restos do stent biodegradável (2) e materiais de malha (fundo ampliado) ainda são visíveis neste ponto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este protocolo apresenta uma técnica simples e acessível para futuras cirurgias reconstrutivas. Uma desvantagem comum na engenharia de tecidos, incluindo a expansão de células autólogas, são as etapas preliminares caras e substanciais necessárias antes do implante cirúrgico. A microenxertia autóloga pode simplificar muitas dessas etapas e potencialmente permitir procedimentos em estágio único. Ao auto-transplantar entidades histológicas complexas, a sinalização parácrina pró-regenerativa é induzida18. Em estudos anteriores, experimentamos que os microenxertos sozinhos são vulneráveis aos ambientes físicos, a menos que sejam adequadamente fixados a umandaime 15,19. O colágeno tem sido estudado como um ambiente viável para expansão tecidual in vitro e foi escolhido para nosso propósito devido à sua biocompatibilidade favorável e disponibilidade comercial. O scaffold composto aqui apresentado foi previamente otimizado durante experimentos in vitro avaliando variações na incorporação de microenxertos e concentrações de colágeno 20,21,22. Antes dos testes in vivo, as propriedades do andaime em relação à permeabilidade, biomecânica e degradação foram avaliadas in vitro20. Além disso, a expansão tecidual baseada em andaime in vivo foi previamente validada em modelos de roedores e coelhos21,22.

O modelo cirúrgico foi escolhido para avaliar uma versão tubular do scaffold, mimetizando o cenário clínico de um desvio urinário para disfunção vesical neurogênica em pacientes pediátricos ou adolescentes. As etapas críticas incluem a dissecção exata dos microenxertos da mucosa e a manutenção de um ambiente úmido desde o momento da ressecção até a incorporação do andaime. Outra etapa crítica inclui a solidificação adequada do hidrogel; A pipetagem cuidadosa do colágeno garante que não se formem bolhas de ar dentro do gel, e as configurações corretas de temperatura e soluções de componentes garantem que o gel solidifique adequadamente. A não obtenção de um gel solidificado aumentará o risco de delaminação do colágeno e descolamento do microenxerto. Para a parte cirúrgica, o manuseio cuidadoso durante o implante é crucial para evitar danos aos microenxertos devido a trauma mecânico ou dissociação. Antes de fechar o abdômen, a permeabilidade de fluidos deve ser cuidadosamente abordada, insuflando a bexiga com fluidos.

As limitações da técnica incluem a espessura do scaffold, que intuitivamente tem limites superiores em relação à difusão de nutrientes do meio externo para os microenxertos. Por outro lado, uma redução na espessura do andaime pode levar a uma permeabilidade inadequadamente alta e vazamento de urina. Nossa composição atual é baseada em avaliações in vitro anteriores, onde a regeneração celular em concentrações variadas de colágeno foi comparada20. A microenxertia de tecidos autólogos também depende de tecido de enxerto saudável, tornando o procedimento atual inadequado para doenças malignas em que o risco de retransplante cancerígeno não pode ser adequadamente descartado23; No entanto, a técnica atual foi projetada para casos com incapacidades miccionais funcionais, onde isso não é considerado um risco. Embora o modelo imite várias etapas do ambiente clínico (ou seja, o procedimento de apendicovesicostomia), este experimento não utiliza um estoma totalmente funcional para desvio urinário, uma vez que o conduto é ligado distalmente. Além disso, como as complicações clínicas podem ocorrer ao longo da vida, um período de observação de 6 semanas pode fornecer conhecimento limitado sobre desfechos específicos sobre estenoses e continência. Portanto, um acompanhamento adicional de 6 meses pode ser adicionado ao estudo após a anastomose do conduto cicatrizado ao nível da pele.

A perspectiva desta técnica está relacionada ao design simples, possibilitando aplicações universais caso o biomaterial de origem do tecido do microenxerto e suporte seja substituído por outras alternativas relevantes. Esses componentes podem ser modificados para atender a propósitos específicos de órgãos relacionados à resistência, elasticidade e biodegradação do andaime. Por fim, os gastos acessíveis e de baixo custo permitem a reprodutibilidade e uma tradução ampliada da técnica.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer à equipe do Departamento de Medicina Experimental (AEM) da Universidade de Copenhague, pela assistência no planejamento e realização de cirurgias e criação de animais, e à ELLA-CS, s.r.o, Hradec Kralove, República Tcheca, por fornecer stents biodegradáveis personalizados usados no estudo. O apoio financeiro foi fornecido pela Sociedade Sueca de Pesquisa Médica, Fundação Promobilia, Fundação Rydbeck, Fundação Samariten, Fundação para Cuidados de Saúde Pediátricos, Fundação Frimurare Barnhuset em Estocolmo e Fundação Novo Nordisk (NNFSA170030576).

Materials

10x MEM Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US 2517592 Collagen preparation
1x MEM Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US 2508924 Collagen preparation
Ambu aScope 4 Cysto Ambu A/S, Ballerup, DK 1000682507 Cystoscope
Aquaflush ACE stopper Abena, Taastrup, DK ACE12/220501 ACE stopper
Borgal vet inj opl 200 + 40 mg/mL Ceva Animal Health A/S 510460 Sulfonamide/Trimethoprim
Bupaq multidose vet 0.3 mg/mL Salfarm Danmark A/S, DK 502763 Buprenorphin
Butomidor vet inj 10 mg/mL Salfarm Danmark A/S, DK 531943 Buthorphanol
Comfortan vet inj 10 mg/mL Dechra Veterinary Products A/S, DK 492312 Metadone
Ethilon suture 3-0 Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US SGBCXV Monofilament non-resorbable
Fentanyl inj 50 µg/mL(hamel) Hameln Pharma ApS, DK 432520 Fentanyl
Ketador vet inj 100 mg/mL Salfarm Danmark A/S, DK 115727 Ketamine
Metacam inj 20 mg/mL t.cattle/pig/horse Boehringer Ingelheim Animal, DE 6443 Meloxcicam
Metacam oral suspension 15 mg/mL pigs Boehringer Ingelheim Animal, DE 482780 Meloxcicam
Omnipaque GF Healthcare, Oslo, NO 16173849 Contrast for CT
Pancytokeratin CK-AE DAKO Agilent, US GA053 Clone AE1/AE3
PDS suture 3-0 Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US SEMMTQ Monofilament slow-resorbable
Prolene suture 4-0 Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US PGH187 Monofilament non-resorbable
Propolipid t.inj/inf 10 mg/mL Fresenius Kabi, DK 21636 Propofol
Rat-tail collagen type I First Link Ltd, Wolverhampton, UK 60-30-810 2.06 mg/mL protein in 0.6% acetic acid
Suprim vet  20 + 100 mg (Solution for use in drinking water) Dechra Veterinary Products A/S, DK 33661 Sulfonamide/Trimethoprim
SX-ELLA Degradable Biliary DV stent ELLA-CS, Trebes, CZ S23000056-01 ø 6 mm x 60 mm
Vicryl mesh Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US VM1208 Mesh
Vicryl suture 4-0 Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US SMBDGDR0 Braided fast-resorbable
Xysol vet inj 20 mg/mL ScanVet Animal Health A/S, DK 54899 Xylazine
Zoletil 50 vet plv/sol t.inj 25 + 25 mg/mL Virbac Danmark A/S, DK 568527 Tiletamine and Zolazepam
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References

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Juul, N., Willacy, O., Buch Kjeldgaard, A., Rootsi, D., Hammelev, K., Chamorro, C. I., Fossum, M. Surgical Model for Single-Staged Tissue-Engineered Urothelial Tubes in Minipigs. J. Vis. Exp. (209), e66936, doi:10.3791/66936 (2024).
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