使用修饰的合成寡核苷酸检测核酸代谢酶

所有生命形式都需要核酸加工酶来执行基本的生物过程，包括复制、转录和 DNA 修复。这些途径的关键酶功能是聚合酶（产生 RNA/DNA 分子的副本）、连接多核苷酸底物的连接酶、降解多核苷酸底物的核酸酶以及解旋酶和拓扑异构酶（熔化核酸双链体或改变其拓扑结构 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 .此外，其中许多酶为克隆、诊断和高通量测序等应用提供了必要的分子工具 11,12,13,14,15。

这些酶的功能特征、动力学和底物特异性可以使用寡核苷酸退火产生的标记 DNA/RNA 底物来确定。传统上，通过在 5′ 链末端引入放射性标记 （³²P） 来实现跟踪基材和产品，然后可以通过照相胶片或荧光粉成像系统进行检测^16,17。虽然放射性标记底物具有提高实验灵敏度并且不会改变核苷酸化学性质的优势，但使用放射性同位素的潜在健康危害鼓励了非放射性核酸标记的发展，为 DNA 和 RNA 检测提供了更安全的替代方案 18,19,20.其中，荧光检测，包括直接荧光检测、时间分辨荧光和能量转移/荧光猝灭测定，是最通用的 21,22,23,24。广泛的荧光基团阵列可实现 DNA/RNA 底物的不同设计，每个寡核苷酸上具有独特的报告基因²⁵。此外，与放射性同位素相比，荧光团的稳定性使用户能够产生和保存大量荧光标记的 DNA 底物¹⁹。这些荧光团标记的底物可以与目标蛋白以及金属和核苷酸辅因子的不同组合一起孵育，以分析结合和/或酶活性。使用带有凝胶成像系统的各种荧光团染料通道可以观察到结合或活性的可视化。由于使用这种技术只能看到荧光标记的寡核苷酸，因此标记的寡核苷酸大小的任何增加或减少都将很容易跟踪。凝胶也可以在之后使用核酸染色染料进行染色，以观察凝胶上存在的所有 DNA 条带。

多核酸连接酶是连接 DNA/RNA 片段的酶，通过在 DNA 的 5′ 磷酸化 DNA 末端和 DNA 的 3′ OH 之间形成磷酸二酯键来催化断裂的密封。根据其核苷酸底物要求，它们可分为两组。高度保守的 NAD 依赖性连接酶存在于所有细菌中²⁶，而结构多样的 ATP 依赖性酶可以通过生命的所有结构域进行鉴定 ^8,27。DNA 连接酶在复制过程中的冈崎片段加工中起重要作用，并通过密封自发性缺口和修复后留下的缺口参与各种 DNA 修复途径，例如核苷酸和碱基切除修复 ^8,10。不同的 DNA 连接酶表现出不同的连接 DNA 断裂不同构象的能力，包括双链断裂、双链断裂、错配和间隙，以及 RNA 和 DNA 杂交体 28,29,30。通过将寡核苷酸与 5′ 磷酸盐退火，可以在核酸双链体中生成并列的 5′ 和 3′ 末端，从而组装各种可连接的底物 31,32,33。最常见的分析方法是通过终点测定形式的尿素 PAGE 进行分离;然而，最近的创新包括使用毛细管凝胶电泳，可实现高通量³⁴、质谱分析³⁵，以及均相分子信标分析，可实现时间分辨监测³⁶。

连接反应的第一步是连接酶被三磷酸腺苷 （ATP） 或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NAD） 使连接酶腺苷酸化，从而产生共价酶中间体。反应的第二步是核酸底物在缺口位点 5′ 端的腺苷酸化，然后连接核酸缺口链。许多在 大肠杆菌 中重组表达的连接酶以腺苷酸化形式纯化，因此能够在不添加核苷酸辅因子的情况下成功连接核酸。这使得很难确定它们连接核酸需要什么特定类型的核苷酸辅因子。除了描述评估 DNA 连接酶活性的测定外，还提出了一种通过使用未标记底物对酶进行去腺苷酸化来可靠地确定辅因子使用的方法。

核酸酶是一大类多样化的 DNA/RNA 修饰酶和催化 RNA，可裂解核酸之间的磷酸二酯键³⁷。核酸酶的功能是 DNA 复制、修复和 RNA 加工所必需的，可以根据它们对 DNA、RNA 或两者的糖特异性进行分类。核酸内切酶水解 DNA/RNA 链内的磷酸二酯键，而核酸外切酶一次水解 DNA/RNA 链从 DNA 的 3′ 或 5′ 末端水解一个核苷酸，并且可以从 DNA 的 3′ 到 5′ 或 5′ 到 3′ 末端进行水解³⁸。

虽然许多核酸酶蛋白是非特异性的，可能涉及多个过程，但其他核酸酶蛋白对特定序列或 DNA 损伤具有高度特异性 ^6,39,40。序列特异性核酸酶用于广泛的生物技术应用，例如克隆、诱变和基因组编辑。这些应用中常用的核酸酶是限制性核酸酶⁴¹、锌指核酸酶⁴²、转录激活因子样效应核酸酶，以及最近的 RNA 引导的工程化 CRISPR 核酸酶⁴³。最近已鉴定出损伤特异性核酸酶，例如 EndoMS 核酸酶，它通过其错配特异性 RecB 样核酸酶结构域对 DNA 中的错配具有特异性 ^5,44。核酸酶活性测定过去是作为放射性标记底物的不连续测定进行的;然而，除了其他缺点外，这些缺点还不允许识别被核酸酶蛋白切割的位点，而使用荧光标记的底物时，这是可能的^45,46。最近，已经开发了连续核酸酶检测，其工作原理是使用与不同状态的 DNA 相互作用的不同 DNA 染料;例如，与 dsDNA 相互作用时发出的荧光信号高于未结合状态，或与短 RNA 特异性结合⁴⁷。其他连续核酸酶检测使用 DNA 发夹，5′ 端有荧光团基团，3′ 端有淬灭基团，因此荧光会随着荧光基团和淬灭基团的分离而降解寡核苷酸⁴⁸。虽然这些分析允许表征 DNA 降解蛋白质的动力学，但它们需要事先了解酶的功能和底物，并且也仅限于改变 DNA 构象以引起染料结合差异的酶。因此，分离单个核酸酶产物的终点检测仍然需要深入了解由蛋白质活性引起的 DNA 修饰。

这里提出了设计荧光标记的 DNA/RNA 寡核苷酸的详细程序，这些寡核苷酸可以混合和匹配以产生用于测试新型核酸酶、聚合酶和连接酶活性的底物。这组基本寡核苷酸序列的验证简化了实验设计，并有助于经济地分析各种酶功能，而无需购买大量定制底物。提供了使用这些底物运行标准 DNA 加工酶测定的详细程序，使用 DNA 连接酶活性和修饰的示例，描述了用于测定和分析核酸酶和聚合酶的修饰。此外，给出了一种用于高精度测定 DNA 连接酶辅因子特异性的改良测定法，并使用双标记探针来评估多组分连接的组装。最后，讨论了对基本检测形式的修改，使其可用于通过电泳迁移率变化测定 （EMSA） 确定蛋白质-DNA 与相同底物的相互作用。