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Biochemistry

MCF-7 세포의 산화 DNA 손상을 평가하기 위해 ELISA 분석을 사용하여 8-oxo-dG 수준 정량화

Published: May 24, 2024
doi:
10.3791/66888
, , ,
1Suzhou Key Laboratory of Medical Biotechnology,Suzhou Vocational Health College, 2Department of Chemistry and Life Sciences,Suzhou University of Science and Technology, 3Department of Thyroid and Breast Surgery,Wuzhong People’s Hospital of Suzhou City

Summary

이 프로토콜은 ELISA 기술을 통해 MCF-7 세포의 DNA 산화 손상을 정량적으로 검출하는 효율적인 방법을 설명합니다.

Abstract

8-Oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dG) 염기는 일반적으로 관찰되는 DNA 산화 손상의 주요한 형태입니다. DNA 손상은 유전자 발현에 지대한 영향을 미치며 신경 퇴행성 질환, 암 및 노화를 자극하는 중추적인 요인으로 작용합니다. 따라서 8-oxoG의 정확한 정량화는 DNA 손상 검출 방법론 연구에서 임상적 중요성을 갖습니다. 그러나 현재 8-oxoG 검출을 위한 기존 접근 방식은 편의성, 편의성, 경제성 및 높은 감도 측면에서 문제를 제기합니다. 우리는 매우 효율적이고 신속한 비색 방법인 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 기술을 사용하여 다양한 농도의 과산화수소(H2O2)로 자극된 MCF-7 세포 샘플에서 8-oxo-dG 함량의 변화를 감지했습니다. MCF-7 세포에서 IC50 값을 검출하여 MCF-7 세포에서 산화 손상을 유도하는H2O2의 농도를 측정하였다. 그 후, MCF-7 세포를 0, 0.25 및 0.75 mM H2O2로 12 시간 동안 처리하고 세포에서 8-oxo-dG를 추출했습니다. 최종적으로, 샘플은 ELISA를 실시하였다. 플레이트 확산, 세척, 배양, 색상 개발, 반응 종료 및 데이터 수집을 포함한 일련의 단계에 따라 H2O2 에 의해 유도 된 MCF-7 세포의 8-oxo-dG 함량 변화를 성공적으로 감지했습니다. 이러한 노력을 통해 세포 샘플 내 DNA 산화 손상 정도를 평가하는 방법을 확립하고, 이를 통해 DNA 손상 검출을 위한 보다 편리하고 편리한 접근 방식의 개발을 추진하는 것을 목표로 합니다. 이러한 노력은 DNA 산화 손상과 질병에 대한 임상 연구 및 독성 물질 검출을 포함한 다양한 영역 간의 연관성 분석을 탐구하는 데 의미 있는 기여를 할 준비가 되어 있습니다.

Introduction

DNA 산화 손상은 활성산소종(ROS)의 생성과 세포의 항산화 방어 체계 사이의 불균형의 결과이다1. 그것은 주로 DNA 퓨린과 피리미딘 염기 2,3의 산화를 포함합니다. DNA 염기의 이러한 산화적 변형은 게놈의 무결성을 손상시킬 뿐만 아니라 암, 신경 퇴행성 질환 및 심혈관 질환을 포함한 광범위한 병리학적 문제를 포함합니다 4,5. DNA의 구아닌 염기는 환원 전위가 가장 낮고 산화에 가장 취약하다6. 따라서 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine(8-oxo-dG)은 DNA 산화 손상 7,8의 정도를 평가하기 위한 주요 마커 역할을 합니다. 8-oxo-dG의 정확한 정량화는 질병 발생, 진행 및 다인자 산화 부담 평가의 다양한 측면을 다루는 데 있어 중요한 문제가 되었다9.

전기화학적 검출을 통한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC-ECD), 질량 분석법 및 관련 하이픈 연결 기술과 같은 8-oxo-dG를 검출하는 기존 방법은 높은 감도 및 특이성을 나타냅니다10,11,12. 그러나 이러한 기법은 복잡한 운영 요구 사항과 높은 비용을 수반하는 경우가 많아 고처리량 시료 분석에서 광범위한 적용 가능성과 실용성을 저해합니다. 과학 기술의 지속적인 발전으로 새롭고 효율적이며 정확한 다양한 방법이 등장했습니다. 이러한 새로운 기술을 적용하면 8-oxo-dG 수치를 보다 정확하게 정량화할 수 있으며 산화 스트레스와 질병 간의 연관성에 대한 심층 연구를 위한 보다 강력한 도구를 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 연구자들은 나노포어 기술을 적용하여 DNA13을 정량적으로 검출 및 시퀀싱하고, 단일 클릭 코드 시퀀싱 전략14을 사용하여 DNA 손상 유형을 식별하고, 고처리량 시퀀싱 방법을 개발하고, 비오틴-스트렙타비딘을 ELISA15와 통합하여 8-oxoG 기반 바이오센서를 만들었습니다. 그 중 ELISA는 특이성, 고처리량 스크리닝 및 비용 측면에서 장점이 인정된 8-oxo-dG 검출에 이상적인 솔루션 중 하나입니다. 따라서 8-oxo-dG를 검출하기 위한 고처리량, 고감도, 편리하고 신속한 분석법을 개발하는 것이 중요합니다.

1971년에 개발된 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 기술은 지난 50년 동안 급속히 발전하여 현재 생물학 및 의학 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 검출 방법 중 하나가 되었다 17,18,19. ELISA 기술은 높은 감도와 특이성을 나타내고, 반응 시간이 짧으며, 사용이 간편하여 대규모 시료 검사 및 고처리량 분석에 널리 인정받고 있습니다20. 결과적으로, ELISA는 세포21,22,23 내의 화합물, 단백질, 항체 또는 분자의 정량적 또는 반정량적 분석에 널리 사용되어 왔다. 예를 들어, 다양한 질병, 약물 잔류물 및 생체 분자와 관련된 바이오마커를 검출하는 데 활용되어 왔다24. ELISA는 실험 설계 및 원칙에 따라 4가지 주요 유형으로 분류할 수 있습니다25. 이러한 방법에는 직접 ELISA, 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA 및 경쟁 ELISA26,27이 포함됩니다. 이 중 표적 분자를 포획하기 위한 항체와 검출을 위한 두 가지 항체를 활용하는 sandwich ELISA가 본 논문의 연구 대상으로 선정되었습니다. 샌드위치 ELISA의 실험 원리는 다음과 같습니다: 첫째, 특정 항체를 마이크로플레이트의 웰에 고정시켜 관심 분석물을 포획합니다. 표준물질 또는 샘플이 첨가된 후 표적 분석물질은 고정화된 항체에 결합합니다. 그 후, 항원에서 다른 epitope를 인식하는 labeled antibody가 첨가되어 sandwich 구조를 형성합니다. 결합되지 않은 항체를 제거한 후 기질을 추가합니다. 2차 항체의 촉매 작용으로 색상 반응이 발생하고 색상의 강도는 샘플의 표적 분석물 농도와 양의 상관관계가 있습니다. 마지막으로, 시료의 농도를 결정하기 위해 광학 밀도(OD)를 측정하였다. Sandwich ELISA는 표적 시료에 대한 감도와 특이성이 증가하는 장점이 있어 저농도의 표적 분석물 및 복잡한 시료를 검출하는 데 적합합니다28. 또한 추가 분석을 위해 얻은 결과를 정량화할 수 있습니다. 이러한 요인으로 인해 샌드위치 ELISA는 과학 연구 및 임상 실험실에서 일반적으로 사용되는 검출 방법이 되었다29.

이 연구는 MCF-7 세포에서 8-oxo-dG를 정량적으로 검출하여 세포의 DNA 산화 손상 정도를 결정하는 것을 목표로 했습니다. 이 연구는 MCF-7 세포 DNA 산화 손상 모델 구축과 ELISA를 사용하여 8-oxo-dG 검출의 두 가지 주요 부분으로 구성됩니다. 먼저, MCF-7 세포를 시험관내에서 배양하고, 서로 다른 기간 동안 서로 다른 농도의H2O2로 처리하였다. 세포 생존율은 MCF-7 세포에서H2O2의 절반-최대 억제 농도(IC 50)를 측정하기 위해 CCK-8 분석을 사용하여 평가되었습니다. IC50 값에 기초하여, 적절한H2O2처리 시간 및 유도 농도를 선택하였다. 산화에 의해 손상된 MCF-7 세포의 샘플을 추출하기 위해 세포 샘플 및 상층액을 얻어 이전에 8-oxo-dG 항체로 코팅된 효소 결합 웰에 첨가했습니다. 샘플에 존재하는 8-oxo-dG는 고체상 담체에 결합된 항체에 결합합니다. 그런 다음, 고추냉이 과산화효소로 표지된 8-oxo-dG 항체를 첨가하였다. 반응 혼합물을 샘플과 항체의 완전한 결합을 보장하기 위해 일정한 온도에서 배양하였다. 결합되지 않은 효소를 세척으로 제거한 다음 비색 기질을 첨가하여 파란색을 생성했습니다. 산의 작용으로 용액이 노랗게 변했습니다. 마지막으로, 반응 웰 샘플의 OD 값을 450nm에서 측정하고, 샘플의 8-oxo-dG 농도는 OD 값에 비례했습니다. 표준 곡선을 생성하여 샘플의 8-oxo-dG 농도를 계산할 수 있습니다.

Protocol

1.MCF-7 세포에서 H2O2 유도 DNA 산화 손상 모델 구축 MCF-7 세포 회수3.5 x 106 MCF-7 세포가 들어 있고 -80°C 냉장고에 보관된 세포 배양 극저온 튜브를 액체 질소가 들어 있는 폼 상자로 빠르게 옮깁니다. 겸자로 튜브를 회수하고 37°C의 일정한 온도의 수조에 약 1분 동안 넣어 보존된 세포를 해동합니다.알림: 수조에서 해동하는 동안 극저?…

Representative Results

그림 3에서 볼 수 있듯이 X축은 MCF-7 세포에 적용된H2O2의 농도를 나타내고 Y축은 세포 생존율을 나타냅니다. 12시간 동안 0.75mM으로 처리한 결과 MCF-7 세포의 생존율이 67%로 감소했습니다. 농도의 증가와 동시에 MCF-7 세포의 생존율은 특히 1.5mM 농도에서 유의하게 감소했으며, 생존율은 3% 미만으로 감소했습니다(표 1). 실험 결과는 MCF-7 세포에 대해 0….

Discussion

ELISA 분석법의 개발은 기존 및 새로운 DNA 손상 검출 방법론 모두에 매우 중요합니다. 기존의 HPLC 및 질량 분석 기법과 비교하여, 이 접근법은 사용자 친화적일 뿐만 아니라 높은 감도를 나타내며 고처리량 스크리닝(30)의 요구를 충족시킨다. 이를 통해 대규모 질병 스크리닝 연구에서 8-oxo-dG를 모니터링할 수 있어 이 바이오마커와 다양한 질병 간의 상관 관계를 더 깊이 이해할 수 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 장쑤 고등 교육 기관 과학 기술 혁신 연구팀(2021), 장쑤 직업 대학 공학 기술 연구 센터 프로그램(2023), 쑤저우 인민 생활 기술 프로젝트 중점 기술 프로그램(SKY2021029), 장쑤 임상 자원 바이오뱅크(TC2021B009) 공개 프로젝트, 국가 방사선 의학 및 보호 중점 연구소 프로젝트의 지원을 받았습니다. Soochow University(GZK12023013), Suzhou Vocational Health College(SZWZYTD202201) 프로그램, 중국 장쑤성 Qing-Lan 프로젝트(2021, 2022).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA(1x) Gibco 25200-072
Cell Counting Kit-8 Dojindo CK04
Cell Counting Plate QiuJing XB-K-25
CO2 incubator Thermo 51032872
DMEM basic(1X) Gibco C11995500BT
FBS PAN ST30-3302
GraphPad Prism X9 GraphPad Software statistical analysis software
H2O2(3%) Jiangxi Caoshanhu Disinfection Co.,Ltd. 1028348
high-speed centrifuge Thermo  9AQ2861
Human 8-oxo-dG ELISA Kit Zcibio ZC-55410
L-1000XLS+ Pipettes Rainin 17014382
L-20XLS+ Pipettes Rainin 17014392
liquid nitrogen tank Mvecryoge YDS-175-216
MCF-7 CELL BNCC BNCC100137
Multiskan FC microplate photometer Thermo 1410101
PBS Solarbio P1020
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X Beyotime C0222
Trinocular live cell microscope Motic 1.1001E+12
Ultra-low temperature freezer Haire V118574
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References

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8-oxo-dGOxidative DNA DamageELISA AssayMCF-7 CellsHydrogen PeroxideDNA Damage DetectionColorimetric MethodQuantificationSandwich ELISA

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Nian, L., Li, X., Du, J., Liu, S. Quantifying the Level of 8-oxo-dG Using ELISA Assay to Evaluate Oxidative DNA Damage in MCF-7 Cells. J. Vis. Exp. (207), e66888, doi:10.3791/66888 (2024).
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