Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar
Summary
Bu makale, tek hücrelerin ve çekirdeklerin dizilimi için gastrulasyon yapan fare embriyolarının yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları için bir boru hattı oluşturur.
Abstract
Son on yılda, tek hücreli yaklaşımlar, örnekler içindeki gen ekspresyon dinamiklerini, hücre heterojenliğini ve hücre durumlarını incelemek için altın standart haline geldi. Tek hücreli ilerlemelerden önce, erken gelişim sırasında dinamik hücresel manzarayı ve hızlı hücre geçişlerini yakalamanın fizibilitesi sınırlıydı. Bu yazıda, embriyonik gün E6.5’ten E8’e kadar olan fare embriyoları üzerinde, gastrulasyonun başlangıcına ve tamamlanmasına karşılık gelen tek hücre ve çekirdek analizi yapmak için sağlam bir boru hattı tasarlanmıştır. Gastrulasyon, gelişim sırasında üç germinal tabakayı oluşturan temel bir süreçtir: organogenez için gerekli olan mezoderm, ektoderm ve endoderm. Yabani tip perigastrulan embriyolara uygulanan tek hücreli omikler hakkında kapsamlı literatür mevcuttur. Bununla birlikte, mutant embriyoların tek hücreli analizi hala azdır ve genellikle FACS’a göre sıralanmış popülasyonlarla sınırlıdır. Bu kısmen genotipleme ihtiyacı, zamanlanmış gebelikler, gebelik başına istenen genotiplere sahip embriyo sayısı ve bu aşamalarda embriyo başına hücre sayısı ile ilişkili teknik kısıtlamalardan kaynaklanmaktadır. Burada, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için tasarlanmış bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yöntem, istenen genotiplerle daha yüksek senkronize gebelik şansı elde etmek için üreme ve zamanlanmış gebelik kılavuzları oluşturur. Embriyo izolasyon sürecindeki optimizasyon adımları, aynı gün genotipleme protokolü (3 saat) ile birleştiğinde, mikro damlacık bazlı tek hücrenin aynı gün gerçekleştirilmesine izin vererek, hücrelerin yüksek canlılığını ve sağlam sonuçları garanti eder. Bu yöntem ayrıca embriyolardan optimal çekirdek izolasyonları için kılavuzları içerir. Böylece, bu yaklaşımlar gastrulasyon aşamasındaki mutant embriyoların tek hücreli yaklaşımlarının uygulanabilirliğini arttırmaktadır. Bu yöntemin, mutasyonların gastrulanın hücresel manzarasını nasıl şekillendirdiğinin analizini kolaylaştıracağını tahmin ediyoruz.
Introduction
Gastrulasyon, normal gelişim için gerekli olan temel bir süreçtir. Bu hızlı ve dinamik süreç, pluripotent hücreler, organların nasıl oluştuğunu tanımlayan soya özgü öncülere geçtiğinde meydana gelir. Yıllar boyunca, gastrulasyon uzun zamandır büyük ölçüde homojen üç popülasyonun oluşumu olarak tanımlandı: mezoderm, ektoderm ve endoderm. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü teknolojiler ve ortaya çıkan sayıda embriyonik kök hücre modeli 1,2, erken germ katmanları arasında benzeri görülmemiş bir heterojenliği ortaya çıkarmaktadır 3,4. Bu, gastrulanın farklı hücre popülasyonlarını düzenleyen mekanizmalar hakkında ortaya çıkarılacak çok daha fazla şey olduğunu göstermektedir. Fare embriyonik gelişimi, gastrulasyon sırasında erken hücre kaderi kararlarını incelemek için en iyi modellerden biri olmuştur 3,5. Farelerde gastrulasyon hızlıdır, çünkü tüm gastrulasyon süreci embriyonik gün E6.5’ten E85’e kadar 48 saat içinde gerçekleşir.
Tek hücre teknolojilerindeki son gelişmeler, vahşi tip fare embriyonik gelişiminin ayrıntılı haritalanmasını sağlayarak, gastrulasyon 3,4,6,7,8 sırasında embriyoların hücresel ve moleküler manzaralarına kapsamlı bir genel bakış sağlamıştır. Bununla birlikte, bu aşamalarda mutant embriyoların analizi daha az yaygındır ve genellikle FACS’a göre sıralanmış popülasyonlarla sınırlıdır 9,10. Kıt literatür, genotipleme gerektiren gastrulasyon yapan embriyoların manipülasyonu ve tek hücreli hazırlanması ile ilgili teknik zorlukları yansıtmaktadır. Dinamik gastrulasyon sürecini yakalamak, özellikle mutant embriyoları anlamak için hızlı doğası nedeniyle zorluklar doğurabilir. Gebeliklerin zamanlaması ve senkronizasyonu çok önemlidir, çünkü zamanlanmış gebelikler arasındaki küçük farklılıklar bile mutant genden kaynaklanan gelişimsel bir fenotip olarak yanlış yorumlanabilir. Bu, mutant gen gastrulasyon sürecini etkilediğinde özellikle önemli hale gelir13,14. Bu çalışmada, vajinal tıkaçların (yani, çiftleşmeden sonra dişinin vajinasında oluşan pıhtılaşmış seminal sıvı kütlesi) görselleştirilmesi yoluyla senkronize gebelikler elde etmek için kılavuzlar oluşturulmuştur. Ek olarak, E6.5’ten E8’e kadar mutant gastrulasyon yapan embriyolardan sağlam tek hücreli veriler elde etmek için bir strateji tasarlanmıştır. Bu strateji, gebelik başına istenen genotipe sahip düşük embriyo sayısı ve embriyoların veya hücrelerin dondurulması-çözülmesinin neden olduğu canlılıktaki azalma ile ilişkili kısıtlamaların üstesinden gelmek için tasarlanmıştır.
Bu makale, vajinal tıkaçlar yoluyla zamanlanmış gebeliklerin oluşturulmasından tek hücrelerin/çekirdeklerin son dizilimine kadar optimize edilmiş bir metodolojiyi açıklamaktadır. Bu yöntem, istenen genotipe sahip daha fazla sayıda embriyo elde etmek için senkronize gebelik sayısının nasıl artırılacağını, hücrelerin canlılığını artırmak için hücre/çekirdek izolasyonlarını ve aynı gün genotipleme protokolünü açıklar. Bu el yazması aynı zamanda farklı gastrulasyon zaman noktalarında embriyo izolasyonu sürecini de açıklamaktadır. Metodoloji, dizileme için nihai canlı embriyo hücrelerinin/çekirdeklerinin sayısını artırmaya yardımcı olur ve yüksek kaliteli dizileme verileri sağlar. Bu nedenle, bu yöntem, genotipleme gerektiren gastrulasyon yapan embriyoların tek hücreli çalışmaları için kapıları açacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, gastrulasyon yapan fare embriyolarından yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları elde etmek için, erken gelişimde hücre kaderi spesifikasyon mekanizmaları üzerine çalışmaları kolaylaştırmak için özel olarak tasarlanmış sağlam bir boru hattı sunulmaktadır. Bu yöntem, cinsiyet veya somatik genler gibi genotipler gerektiren embriyoların analizini optimize ederek gastrulasyon alanındaki çok önemli bir boşluğu giderir. Genetik mutasyon fare modellerini kullanarak ve t?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fox Chase Kanser Merkezi’ndeki Genomik Çekirdeği’ne ve dizileme deneyleri için teknik destek için Dr. Johnathan Whetstine laboratuvar üyeleri Zach Gray, Madison Honer ve Benjamin Ferman’a teşekkür ederiz. Dr. Estaras’ın laboratuvar üyelerine ve tek hücreli çalışmaların ilk analizine katkıda bulunan bir rotasyon yüksek lisans öğrencisi olan Alex Morris’e teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibeleri tarafından finanse edilmektedir R01HD106969 ve Conchi Estaras’a R56HL163146. Ek olarak, Elizabeth Abraham, T32 eğitim hibesi 5T32HL091804-12 tarafından desteklendi.
Materials
| 10 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 1000 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 23-430 | |
| 20 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-404 | |
| 300 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-415 | |
| 37 µm Reversible Strainer, small | Stem Cell | 27215 | |
| 6 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-260 | |
| 8-strip PCR tubes | Genesee Scientific | 27-125U | |
| Agarose | Apex Bioresearch Product | 20-102 | |
| Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath | Genesee | 31-437 | |
| Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge | Genesee | 33-759R | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Chromium Controller | 10X | PN-1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X | PN-1000269 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Couning Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Digitonin | ThermoFisher Scientific | BN2006 | |
| DirectPCR yolk sac | Viagen | 201-Y | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x) | CORNING | 10-013-CV | |
| Dulbecco's PBS | GenClone | 25-508 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol | Koptec | V1401 | |
| EVOS M7000 Imaging System | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| GoTaq G2 Green Master Mix | Promega | M7823 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| MgCl2 | ThermoFisher Scientific | AC223211000 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 | Illumina | 20046811 | |
| NextSeq2000 | Illumina | ||
| Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope | Nikon | ||
| Nondiedt P40 | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free Water | GenClone | 25-511 | |
| Optical Tube 8x Strip (401428) | Agilent | 401428 | |
| Optical Tube Cap 8x Strip (401425) | Agilent | 401425 | |
| Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit | Genesee | 31-511 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| Qubit dsDNA Quantification Assay Kits | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit Flex 3 | Invitrogen | ||
| RNase inhibitor | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Tape Station Loading tips | Agilent | 5067-5598 | |
| Tapestation 4150 | Agilent | G2992AA | |
| Tris-HCL (Ph7) | Quality Biological | 351-007-101 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Theromo Fisher Scientific | T10282 | |
| Tryple Express | Gibco | 12604-021 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter | IKA | 3617000 |
References
- Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
- Kim, Y., Kim, I., Shin, K. A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond: from blastoids to synthetic embryos and beyond. Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).
- Pijuan-Sala, B., et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).
- Mittnenzweig, M., et al. A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation. Cell. 184 (11), P2825-P2842.E22 (2021).
- Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate. Mech Dev. 163, 103617 (2020).
- Argelaguet, R., et al. Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution. Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- Mohammed, H., et al. Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation. Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).
- Lescroart, F., et al. Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq. Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).
- Scialdone, A., et al. Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling. Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).
- . 10X Genomics. Chromium Next GEM single cell 3′ reagent kits v3.1: User guide Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry (2024)
- . NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol Available from: https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm (2024)
- Dai, H. Q., et al. TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling. Nature. 538, 528-532 (2016).
- Li, Q., et al. Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation. Nat Commun. 14 (1), 2922 (2023).
- Saga, Y., et al. MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube. Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Mol Cell. 65 (4), 631-643.e4 (2017).
.