Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación
Summary
Este artículo establece una línea para suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad de embriones de ratón gastrulados para la secuenciación de células individuales y núcleos.
Abstract
Durante la última década, los enfoques unicelulares se han convertido en el estándar de oro para estudiar la dinámica de la expresión génica, la heterogeneidad celular y los estados celulares dentro de las muestras. Antes de los avances de una sola célula, la viabilidad de capturar el paisaje celular dinámico y las transiciones celulares rápidas durante el desarrollo temprano era limitada. En este trabajo, se diseñó una tubería robusta para realizar análisis de células individuales y núcleos en embriones de ratón desde el día embrionario E6.5 hasta E8, correspondiente al inicio y finalización de la gastrulación. La gastrulación es un proceso fundamental durante el desarrollo que establece las tres capas germinales: mesodermo, ectodermo y endodermo, que son esenciales para la organogénesis. Se dispone de una amplia bibliografía sobre ómicas unicelulares aplicadas a embriones perigastruladores de tipo salvaje. Sin embargo, el análisis de embriones mutantes de una sola célula sigue siendo escaso y, a menudo, se limita a poblaciones clasificadas por FACS. Esto se debe en parte a las limitaciones técnicas asociadas con la necesidad de genotipado, embarazos cronometrados, el recuento de embriones con genotipos deseados por embarazo y el número de células por embrión en estas etapas. Aquí, se presenta una metodología diseñada para superar estas limitaciones. Este método establece pautas de reproducción y embarazo cronometrado para lograr una mayor probabilidad de embarazos sincronizados con los genotipos deseados. Los pasos de optimización en el proceso de aislamiento embrionario, junto con un protocolo de genotipado en el mismo día (3 h), permiten realizar una sola célula basada en microgotas en el mismo día, lo que garantiza una alta viabilidad de las células y resultados sólidos. Este método incluye además pautas para el aislamiento óptimo de los núcleos de los embriones. Por lo tanto, estos enfoques aumentan la viabilidad de los enfoques unicelulares de embriones mutantes en la etapa de gastrulación. Anticipamos que este método facilitará el análisis de cómo las mutaciones dan forma al paisaje celular de la gástrula.
Introduction
La gastrulación es un proceso fundamental necesario para el desarrollo normal. Este proceso rápido y dinámico ocurre cuando las células pluripotentes se convierten en precursores específicos del linaje que definen cómo se forman los órganos. Durante años, la gastrulación se definió como la formación de tres poblaciones en gran medida homogéneas: mesodermo, ectodermo y endodermo. Sin embargo, las tecnologías de alta resolución y un número emergente de modelos de células madre embrionarias 1,2 revelan una heterogeneidad sin precedentes entre las primeras capas germinales 3,4. Esto sugiere que aún queda mucho por descubrir sobre los mecanismos que regulan las distintas poblaciones celulares de la gástrula. El desarrollo embrionario del ratón ha sido uno de los mejores modelos para estudiar las decisiones tempranas sobre el destino celular durante la gastrulación 3,5. La gastrulación en ratones es rápida, ya que todo el proceso de gastrulación ocurre dentro de las 48 h, desde el día embrionario E6.5 hasta el E85.
Los avances recientes en las tecnologías unicelulares han permitido un mapeo detallado del desarrollo embrionario de ratones de tipo salvaje, proporcionando una visión completa de los paisajes celulares y moleculares de los embriones durante la gastrulación 3,4,6,7,8. Sin embargo, el análisis de embriones mutantes en estas etapas es menos común y a menudo se limita a poblaciones clasificadas por FACS 9,10. La escasa literatura refleja los desafíos técnicos asociados con la manipulación y preparación unicelular de embriones gastrulados que requieren genotipado. Capturar el proceso dinámico de la gastrulación puede plantear desafíos debido a su naturaleza rápida, especialmente para comprender los embriones mutantes. El momento y la sincronización de los embarazos son esenciales, ya que incluso las pequeñas diferencias entre los embarazos cronometrados pueden malinterpretarse como un fenotipo de desarrollo resultante del gen mutante. Esto se vuelve particularmente importante cuando el gen mutante influye en el proceso de gastrulación13,14. En este estudio se establecen pautas para obtener embarazos sincronizados a través de la visualización de tapones vaginales (es decir, la masa de líquido seminal coagulado que se forma en la vagina de la hembra después del apareamiento). Además, se diseña una estrategia para obtener datos robustos de una sola célula de embriones mutantes con gastrulación de E6.5 a E8. Esta estrategia está concebida para superar las limitaciones asociadas al bajo número de embriones con el genotipo deseado por embarazo y a la disminución de la viabilidad provocada por la congelación-descongelación de embriones o células.
Este artículo describe una metodología optimizada desde el establecimiento de embarazos cronometrados a través de tapones vaginales hasta la secuenciación final de células/núcleos individuales. Este método explica cómo aumentar el número de embarazos sincronizados para obtener un mayor número de embriones con el genotipo deseado, aislamientos de células/núcleos para mejorar la viabilidad de las células y un protocolo de genotipado en el mismo día. Este manuscrito también describe el proceso de aislamiento embrionario en diferentes momentos de gastrulación. La metodología ayuda a aumentar el número de células/núcleos de embriones viables finales para la secuenciación, lo que garantiza datos de secuenciación de alta calidad. Por lo tanto, este método abrirá las puertas a estudios unicelulares de embriones gastrulados que requieran genotipado.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo se presenta una sólida cartera de productos para la obtención de suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad a partir de embriones de ratón gastrulados, diseñada específicamente para facilitar los estudios sobre los mecanismos de especificación del destino celular en el desarrollo temprano. Este método aborda una brecha crucial en el campo de la gastrulación al optimizar el análisis de embriones que requieren genotipos, como el sexo o los genes somáticos. Mediante la utili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Núcleo de Genómica del Centro Oncológico Fox Chase y a los miembros del laboratorio del Dr. Johnathan Whetstine, Zach Gray, Madison Honer y Benjamin Ferman por su apoyo técnico para los experimentos de secuenciación. Agradecemos a los miembros de laboratorio del Dr. Estaras y Alex Morris, un estudiante graduado de rotación que contribuyó al análisis inicial de los estudios de células individuales. Este trabajo está financiado por las subvenciones de los NIH R01HD106969 y R56HL163146 a Conchi Estaras. Además, Elizabeth Abraham recibió el apoyo de la beca de formación T32 5T32HL091804-12.
Materials
| 10 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 1000 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 23-430 | |
| 20 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-404 | |
| 300 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-415 | |
| 37 µm Reversible Strainer, small | Stem Cell | 27215 | |
| 6 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-260 | |
| 8-strip PCR tubes | Genesee Scientific | 27-125U | |
| Agarose | Apex Bioresearch Product | 20-102 | |
| Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath | Genesee | 31-437 | |
| Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge | Genesee | 33-759R | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Chromium Controller | 10X | PN-1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X | PN-1000269 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Couning Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Digitonin | ThermoFisher Scientific | BN2006 | |
| DirectPCR yolk sac | Viagen | 201-Y | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x) | CORNING | 10-013-CV | |
| Dulbecco's PBS | GenClone | 25-508 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol | Koptec | V1401 | |
| EVOS M7000 Imaging System | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| GoTaq G2 Green Master Mix | Promega | M7823 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| MgCl2 | ThermoFisher Scientific | AC223211000 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 | Illumina | 20046811 | |
| NextSeq2000 | Illumina | ||
| Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope | Nikon | ||
| Nondiedt P40 | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free Water | GenClone | 25-511 | |
| Optical Tube 8x Strip (401428) | Agilent | 401428 | |
| Optical Tube Cap 8x Strip (401425) | Agilent | 401425 | |
| Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit | Genesee | 31-511 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| Qubit dsDNA Quantification Assay Kits | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit Flex 3 | Invitrogen | ||
| RNase inhibitor | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Tape Station Loading tips | Agilent | 5067-5598 | |
| Tapestation 4150 | Agilent | G2992AA | |
| Tris-HCL (Ph7) | Quality Biological | 351-007-101 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Theromo Fisher Scientific | T10282 | |
| Tryple Express | Gibco | 12604-021 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter | IKA | 3617000 |
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