Секвенирование РНК одиночных клеток мутантных цельных эмбрионов мыши: от эпибласта до конца гаструляции
Summary
В этой статье описывается конвейер для высококачественных суспензий одиночных клеток и ядер гаструляционных эмбрионов мышей для секвенирования отдельных клеток и ядер.
Abstract
За последнее десятилетие подходы с использованием одиночных клеток стали золотым стандартом для изучения динамики экспрессии генов, гетерогенности клеток и состояния клеток в образцах. До появления одиночных клеток возможность захвата динамического клеточного ландшафта и быстрых переходов клеток на ранних этапах развития была ограничена. В данной работе был разработан надежный конвейер для проведения анализа одиночных клеток и ядер эмбрионов мышей с эмбрионов с эмбрионального дня E6,5 по E8, что соответствует началу и завершению гаструляции. Гаструляция является фундаментальным процессом в процессе развития, в ходе которого образуются три зародышевых слоя: мезодерма, эктодерма и энтодерма, которые необходимы для органогенеза. Имеется обширная литература по омиксам одиночных клеток, применяемым к перигаструляционным эмбрионам дикого типа. Тем не менее, одноклеточный анализ мутантных эмбрионов все еще редок и часто ограничен популяциями, отсортированными с помощью FACS. Отчасти это связано с техническими ограничениями, связанными с необходимостью генотипирования, сроками беременности, количеством эмбрионов с желаемыми генотипами за одну беременность и количеством клеток на эмбрион на этих стадиях. В данной статье представлена методология, призванная преодолеть эти ограничения. Этот метод устанавливает рекомендации по разведению и срокам беременности для достижения более высокой вероятности синхронизированной беременности с желаемыми генотипами. Этапы оптимизации процесса выделения эмбрионов в сочетании с протоколом генотипирования в тот же день (3 ч) позволяют проводить одноклеточное исследование на основе микрокапель в тот же день, что обеспечивает высокую жизнеспособность клеток и надежные результаты. Этот метод также включает в себя рекомендации по оптимальному выделению ядер из эмбрионов. Таким образом, эти подходы повышают целесообразность одноклеточных подходов к мутантным эмбрионам на стадии гаструляции. Мы ожидаем, что этот метод облегчит анализ того, как мутации формируют клеточный ландшафт гаструлы.
Introduction
Гаструляция является фундаментальным процессом, необходимым для нормального развития. Этот быстрый и динамичный процесс происходит, когда плюрипотентные клетки превращаются в предшественников, специфичных для линии, которые определяют формирование органов. В течение многих лет гаструляция долгое время определялась как формирование трех в значительной степени однородных популяций: мезодермы, эктодермы и энтодермы. Тем не менее, технологии с высоким разрешением и растущее число моделей эмбриональных стволовых клеток 1,2 обнаруживают беспрецедентную гетерогенность среди ранних зародышевых слоев 3,4. Это говорит о том, что еще многое предстоит выяснить о механизмах, регулирующих различные клеточные популяции гаструлы. Эмбриональное развитие мышей было одной из лучших моделей для изучения ранних решений о судьбе клеток во время гаструляции 3,5. Гаструляция у мышей происходит быстро, так как весь процесс гаструляции происходит в течение 48 ч, от эмбрионального дня Е6,5 до Е855.
Последние достижения в области технологий одиночных клеток позволили детально составить карту развития эмбриона мыши дикого типа, обеспечив всесторонний обзор клеточных и молекулярных ландшафтов эмбрионов во время гаструляции 3,4,6,7,8. Однако анализ мутантных эмбрионов на этих стадиях встречается реже и часто ограничивается популяциями, отсортированными методом FACS 9,10. Скудная литература отражает технические проблемы, связанные с манипуляциями и одноклеточным препарированием гаструляционных эмбрионов, требующих генотипирования. Захват динамического процесса гаструляции может быть сопряжен с трудностями из-за его быстрого характера, особенно для понимания мутантных эмбрионов. Сроки и синхронизация беременностей имеют важное значение, так как даже незначительные различия между сроками беременности могут быть неверно истолкованы как фенотип развития, возникающий в результате мутантного гена. Это становится особенно важным, когда мутантный ген влияет на процесс гаструляции13,14. В данном исследовании установлены рекомендации по получению синхронизированной беременности за счет визуализации вагинальных пробок (т.е. массы свернувшейся семенной жидкости, образующейся во влагалище самки после спаривания). Кроме того, разработана стратегия для получения надежных данных об отдельных клетках мутантных гаструляционных эмбрионов от E6.5 до E8. Эта стратегия разработана для преодоления ограничений, связанных с низким количеством эмбрионов с желаемым генотипом за одну беременность и снижением жизнеспособности, вызванным замораживанием-размораживанием эмбрионов или клеток.
В этой статье описывается оптимизированная методология от установления временной беременности с помощью вагинальных пробок до окончательного секвенирования отдельных клеток/ядер. Этот метод объясняет, как увеличить количество синхронизированных беременностей для получения большего числа эмбрионов с желаемым генотипом, выделения клеток/ядер для улучшения жизнеспособности клеток и протокола генотипирования в тот же день. В данной рукописи также описан процесс выделения эмбрионов в различные моменты времени гаструляции. Методология помогает увеличить количество конечных жизнеспособных эмбриональных клеток/ядер для секвенирования, обеспечивая высокое качество данных секвенирования. Таким образом, этот метод откроет двери для одноклеточных исследований гаструляционных эмбрионов, требующих генотипирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе представлен надежный конвейер для получения высококачественных суспензий одиночных клеток и ядер из гаструляционных эмбрионов мышей, специально разработанный для облегчения исследований механизмов спецификации клеточной судьбы на ранних стадиях развития. Этот мето…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем признательность Ядру геномики в Онкологическом центре Фокс Чейз и сотрудникам лаборатории доктора Джонатана Веттайна Заку Грею, Мэдисон Хонер и Бенджамину Ферману за техническую поддержку экспериментов по секвенированию. Мы выражаем признательность членам лаборатории доктору Эстарасу и Алексу Моррису, аспиранту, которые внесли свой вклад в первоначальный анализ исследований одиночных клеток. Эта работа финансируется за счет грантов NIH R01HD106969 и R56HL163146 Conchi Estaras. Кроме того, Элизабет Абрахам получила грант на обучение T32 5T32HL091804-12.
Materials
| 10 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 1000 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 23-430 | |
| 20 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-404 | |
| 300 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-415 | |
| 37 µm Reversible Strainer, small | Stem Cell | 27215 | |
| 6 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-260 | |
| 8-strip PCR tubes | Genesee Scientific | 27-125U | |
| Agarose | Apex Bioresearch Product | 20-102 | |
| Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath | Genesee | 31-437 | |
| Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge | Genesee | 33-759R | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Chromium Controller | 10X | PN-1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X | PN-1000269 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Couning Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Digitonin | ThermoFisher Scientific | BN2006 | |
| DirectPCR yolk sac | Viagen | 201-Y | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x) | CORNING | 10-013-CV | |
| Dulbecco's PBS | GenClone | 25-508 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol | Koptec | V1401 | |
| EVOS M7000 Imaging System | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| GoTaq G2 Green Master Mix | Promega | M7823 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| MgCl2 | ThermoFisher Scientific | AC223211000 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 | Illumina | 20046811 | |
| NextSeq2000 | Illumina | ||
| Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope | Nikon | ||
| Nondiedt P40 | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free Water | GenClone | 25-511 | |
| Optical Tube 8x Strip (401428) | Agilent | 401428 | |
| Optical Tube Cap 8x Strip (401425) | Agilent | 401425 | |
| Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit | Genesee | 31-511 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| Qubit dsDNA Quantification Assay Kits | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit Flex 3 | Invitrogen | ||
| RNase inhibitor | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Tape Station Loading tips | Agilent | 5067-5598 | |
| Tapestation 4150 | Agilent | G2992AA | |
| Tris-HCL (Ph7) | Quality Biological | 351-007-101 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Theromo Fisher Scientific | T10282 | |
| Tryple Express | Gibco | 12604-021 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter | IKA | 3617000 |
References
- Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
- Kim, Y., Kim, I., Shin, K. A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond: from blastoids to synthetic embryos and beyond. Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).
- Pijuan-Sala, B., et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).
- Mittnenzweig, M., et al. A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation. Cell. 184 (11), P2825-P2842.E22 (2021).
- Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate. Mech Dev. 163, 103617 (2020).
- Argelaguet, R., et al. Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution. Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- Mohammed, H., et al. Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation. Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).
- Lescroart, F., et al. Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq. Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).
- Scialdone, A., et al. Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling. Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).
- . 10X Genomics. Chromium Next GEM single cell 3′ reagent kits v3.1: User guide Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry (2024)
- . NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol Available from: https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm (2024)
- Dai, H. Q., et al. TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling. Nature. 538, 528-532 (2016).
- Li, Q., et al. Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation. Nat Commun. 14 (1), 2922 (2023).
- Saga, Y., et al. MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube. Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Mol Cell. 65 (4), 631-643.e4 (2017).
.