Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação
Summary
Este artigo estabelece um pipeline para suspensões de células e núcleos únicos de alta qualidade de embriões de camundongos gastrulados para sequenciamento de células e núcleos únicos.
Abstract
Na última década, as abordagens de célula única tornaram-se o padrão-ouro para estudar a dinâmica da expressão gênica, a heterogeneidade celular e os estados celulares nas amostras. Antes dos avanços de uma única célula, a viabilidade de capturar a paisagem celular dinâmica e as transições celulares rápidas durante o desenvolvimento inicial era limitada. Neste artigo, um pipeline robusto foi projetado para realizar análises de células únicas e núcleos em embriões de camundongos do dia embrionário E6.5 a E8, correspondendo ao início e conclusão da gastrulação. A gastrulação é um processo fundamental durante o desenvolvimento que estabelece as três camadas germinativas: mesoderma, ectoderme e endoderme, que são essenciais para a organogênese. Extensa literatura está disponível sobre ômicas unicelulares aplicadas a embriões perigastrulantes do tipo selvagem. No entanto, a análise de células únicas de embriões mutantes ainda é escassa e muitas vezes limitada a populações classificadas por FACS. Isso se deve em parte às restrições técnicas associadas à necessidade de genotipagem, gestações cronometradas, contagem de embriões com genótipos desejados por gravidez e número de células por embrião nesses estágios. Aqui, é apresentada uma metodologia projetada para superar essas limitações. Este método estabelece diretrizes de reprodução e gravidez programada para obter uma maior chance de gestações sincronizadas com os genótipos desejados. As etapas de otimização no processo de isolamento do embrião, juntamente com um protocolo de genotipagem no mesmo dia (3 h), permitem que a célula única baseada em microgotículas seja realizada no mesmo dia, garantindo a alta viabilidade das células e resultados robustos. Este método inclui ainda diretrizes para isolamentos ideais de núcleos de embriões. Assim, essas abordagens aumentam a viabilidade de abordagens unicelulares de embriões mutantes no estágio de gastrulação. Prevemos que este método facilitará a análise de como as mutações moldam a paisagem celular da gástrula.
Introduction
A gastrulação é um processo fundamental necessário para o desenvolvimento normal. Esse processo rápido e dinâmico ocorre quando as células pluripotentes fazem a transição para precursores específicos da linhagem que definem como os órgãos se formam. Durante anos, a gastrulação foi definida por muito tempo como a formação de três populações amplamente homogêneas: mesoderma, ectoderma e endoderme. No entanto, tecnologias de alta resolução e um número emergente de modelos de células-tronco embrionárias 1,2 revelam heterogeneidade sem precedentes entre as camadas germinativas iniciais 3,4. Isso sugere que ainda há muito a ser descoberto sobre os mecanismos que regulam as distintas populações de células da gástrula. O desenvolvimento embrionário de camundongos tem sido um dos melhores modelos para estudar as decisões iniciais do destino celular durante a gastrulação 3,5. A gastrulação em camundongos é rápida, pois todo o processo de gastrulação ocorre em 48 h, do dia embrionário E6.5 a E85.
Avanços recentes em tecnologias de célula única permitiram o mapeamento detalhado do desenvolvimento embrionário de camundongos do tipo selvagem, fornecendo uma visão abrangente das paisagens celulares e moleculares dos embriões durante a gastrulação 3,4,6,7,8. No entanto, a análise de embriões mutantes nesses estágios é menos comum e muitas vezes limitada a populações classificadas por FACS 9,10. A escassa literatura reflete os desafios técnicos associados à manipulação e preparação unicelular de embriões gastrulantes que requerem genotipagem. Capturar o processo dinâmico de gastrulação pode representar desafios devido à sua natureza rápida, especialmente para a compreensão de embriões mutantes. O tempo e a sincronização das gestações são essenciais, pois mesmo pequenas diferenças entre as gestações programadas podem ser mal interpretadas como um fenótipo de desenvolvimento resultante do gene mutante. Isso se torna particularmente importante quando o gene mutante influencia o processo de gastrulação13,14. Neste estudo, são estabelecidas diretrizes para a obtenção de gestações sincronizadas por meio da visualização de tampões vaginais (ou seja, a massa de líquido seminal coagulado formada na vagina da fêmea após o acasalamento). Além disso, uma estratégia é projetada para obter dados robustos de células únicas de embriões gastrulantes mutantes de E6.5 a E8. Esta estratégia é concebida para superar as restrições associadas ao baixo número de embriões com o genótipo desejado por gravidez e à diminuição da viabilidade causada pelo congelamento e descongelamento de embriões ou células.
Este artigo descreve uma metodologia otimizada desde o estabelecimento de gestações programadas por meio de tampões vaginais até o sequenciamento final de células/núcleos únicos. Este método explica como aumentar o número de gestações sincronizadas para obter um número maior de embriões com o genótipo desejado, isolamentos de células/núcleos para melhorar a viabilidade das células e um protocolo de genotipagem no mesmo dia. Este manuscrito também descreve o processo de isolamento embrionário em diferentes momentos de gastrulação. A metodologia ajuda a aumentar o número de células/núcleos embrionários viáveis finais para sequenciamento, garantindo dados de sequenciamento de alta qualidade. Portanto, este método abrirá as portas para estudos de células únicas de embriões gastrulantes que requerem genotipagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um pipeline robusto é apresentado neste artigo para a obtenção de suspensões unicelulares e de núcleos de alta qualidade a partir de embriões de camundongos gastrulados, especificamente projetados para facilitar estudos sobre mecanismos de especificação de destino celular no desenvolvimento inicial. Este método aborda uma lacuna crucial no campo da gastrulação, otimizando a análise de embriões que requerem genótipos, como genes sexuais ou somáticos. Ao utilizar modelos de camundongos com mutação genétic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Núcleo de Genômica do Fox Chase Cancer Center e aos membros do laboratório Dr. Johnathan Whetstine Zach Gray, Madison Honer e Benjamin Ferman pelo suporte técnico para os experimentos de sequenciamento. Reconhecemos os membros do laboratório do Dr. Estaras e Alex Morris, um estudante de pós-graduação rotativo que contribuiu para a análise inicial dos estudos de célula única. Este trabalho é financiado pelas bolsas do NIH R01HD106969 e R56HL163146 para Conchi Estaras. Além disso, Elizabeth Abraham foi apoiada pela bolsa de treinamento T32 5T32HL091804-12.
Materials
| 10 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 1000 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 23-430 | |
| 20 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-404 | |
| 300 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-415 | |
| 37 µm Reversible Strainer, small | Stem Cell | 27215 | |
| 6 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-260 | |
| 8-strip PCR tubes | Genesee Scientific | 27-125U | |
| Agarose | Apex Bioresearch Product | 20-102 | |
| Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath | Genesee | 31-437 | |
| Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge | Genesee | 33-759R | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Chromium Controller | 10X | PN-1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X | PN-1000269 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Couning Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Digitonin | ThermoFisher Scientific | BN2006 | |
| DirectPCR yolk sac | Viagen | 201-Y | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x) | CORNING | 10-013-CV | |
| Dulbecco's PBS | GenClone | 25-508 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol | Koptec | V1401 | |
| EVOS M7000 Imaging System | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| GoTaq G2 Green Master Mix | Promega | M7823 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| MgCl2 | ThermoFisher Scientific | AC223211000 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 | Illumina | 20046811 | |
| NextSeq2000 | Illumina | ||
| Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope | Nikon | ||
| Nondiedt P40 | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free Water | GenClone | 25-511 | |
| Optical Tube 8x Strip (401428) | Agilent | 401428 | |
| Optical Tube Cap 8x Strip (401425) | Agilent | 401425 | |
| Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit | Genesee | 31-511 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| Qubit dsDNA Quantification Assay Kits | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit Flex 3 | Invitrogen | ||
| RNase inhibitor | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Tape Station Loading tips | Agilent | 5067-5598 | |
| Tapestation 4150 | Agilent | G2992AA | |
| Tris-HCL (Ph7) | Quality Biological | 351-007-101 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Theromo Fisher Scientific | T10282 | |
| Tryple Express | Gibco | 12604-021 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter | IKA | 3617000 |
References
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