変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

生殖は、正常な発達に必要な基本的なプロセスです。この急速でダイナミックなプロセスは、多能性細胞が臓器の形成方法を定義する系統特異的な前駆体に移行するときに発生します。長年にわたり、原腸陥入は、中胚葉、外胚葉、内胚葉の3つの大部分が均質な集団の形成と定義されてきました。しかし、高解像度技術と新たな数の胚性幹細胞モデル^1,2により、初期の胚細胞層^3,4の間に前例のない不均一性が明らかになりました。このことは、原腸の異なる細胞集団を調節するメカニズムについては、まだ解明されていないことがたくさんあることを示唆しています。マウスの胚発生は、原腸陥入中の初期の細胞運命決定を研究するための最良のモデルの1つです^3,5。マウスの胃腸陥入は急速で、原腸陥入の全過程は胚の日E6.5からE8⁵までの48時間以内に起こります。

近年のシングルセル技術の進歩により、野生型マウスの胚発生の詳細なマッピングが可能になり、原腸陥入中の胚の細胞および分子ランドスケープの包括的な概観が得られました3,4,6,7,8。しかし、これらの段階での変異胚の解析はあまり一般的ではなく、しばしばFACSで選別された集団に限定されている^9,10。この希少な文献は、ジェノタイピングを必要とする原腸陥入胚の操作と単一細胞調製に関連する技術的な課題を反映しています。原腸陥入のダイナミックな過程を捉えることは、特に変異胚を理解するために、その急速な性質のために課題を引き起こす可能性があります。妊娠のタイミングと同期は不可欠であり、妊娠のタイミング間のわずかな違いでさえ、突然変異遺伝子に起因する発生表現型と誤解される可能性があります。これは、突然変異遺伝子が原腸陥入のプロセスに影響を与える場合に特に重要になります^13,14。この研究では、膣栓(つまり、交尾後に女性の膣内に形成される凝固した精液の塊)の視覚化を通じて同期妊娠を取得するためのガイドラインが確立されています。さらに、E6.5からE8までの突然変異原腸陥入胚から堅牢な単一細胞データを取得する戦略が設計されています。この戦略は、妊娠ごとに目的の遺伝子型を持つ胚の数が少ないこと、および凍結融解する胚または細胞によって引き起こされる生存率の低下に関連する制約を克服するために考案されています。

この論文では、膣プラグによる時限妊娠の確立から、単一細胞/核の最終的なシーケンシングまで、最適化された方法論について説明します。この方法は、所望の遺伝子型を持つ胚の数を増やすために同期妊娠の数を増やす方法、細胞の生存率を改善するための細胞/核の単離、および同日のジェノタイピングプロトコルを説明する。この原稿では、さまざまな原腸陥入の時点での胚分離のプロセスについても説明しています。この方法論は、シーケンシングのための最終生存胚細胞/核の数を増やすのに役立ち、高品質のシーケンシングデータを確保します。したがって、この方法は、ジェノタイピングを必要とする原腸陥入胚の単一細胞研究への扉を開くことになります。