Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione
Summary
Questo articolo stabilisce una pipeline per sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule e nuclei.
Abstract
Nell’ultimo decennio, gli approcci a singola cellula sono diventati il gold standard per lo studio della dinamica dell’espressione genica, dell’eterogeneità cellulare e degli stati cellulari all’interno dei campioni. Prima dell’avanzamento delle singole cellule, la possibilità di catturare il panorama cellulare dinamico e le rapide transizioni cellulari durante lo sviluppo iniziale era limitata. In questo articolo, è stata progettata una robusta pipeline per eseguire analisi di singole cellule e nuclei su embrioni di topo dal giorno embrionale E6.5 a E8, corrispondente all’inizio e al completamento della gastrulazione. La gastrulazione è un processo fondamentale durante lo sviluppo che stabilisce i tre strati germinali: mesoderma, ectoderma ed endoderma, che sono essenziali per l’organogenesi. È disponibile un’ampia letteratura sulle omiche a singola cellula applicate agli embrioni perigastrulanti wild-type. Tuttavia, l’analisi di embrioni mutanti su singole cellule è ancora scarsa e spesso limitata alle popolazioni selezionate con FACS. Ciò è in parte dovuto ai vincoli tecnici associati alla necessità di genotipizzazione, alle gravidanze programmate, al numero di embrioni con genotipi desiderati per gravidanza e al numero di cellule per embrione in queste fasi. Qui viene presentata una metodologia progettata per superare questi limiti. Questo metodo stabilisce linee guida per l’allevamento e la gravidanza a tempo per ottenere una maggiore possibilità di gravidanze sincronizzate con i genotipi desiderati. Le fasi di ottimizzazione del processo di isolamento dell’embrione, abbinate a un protocollo di genotipizzazione in giornata (3 ore), consentono di eseguire una singola cellula basata su microgoccioline nello stesso giorno, garantendo un’elevata vitalità delle cellule e risultati robusti. Questo metodo include inoltre linee guida per l’isolamento ottimale dei nuclei dagli embrioni. Pertanto, questi approcci aumentano la fattibilità di approcci a singola cellula di embrioni mutanti nella fase di gastrulazione. Prevediamo che questo metodo faciliterà l’analisi di come le mutazioni modellano il paesaggio cellulare della gastrula.
Introduction
La gastrulazione è un processo fondamentale necessario per il normale sviluppo. Questo processo rapido e dinamico si verifica quando le cellule pluripotenti si trasformano in precursori specifici del lignaggio che definiscono il modo in cui si formano gli organi. Per anni, la gastrulazione è stata a lungo definita come la formazione di tre popolazioni in gran parte omogenee: mesoderma, ectoderma ed endoderma. Tuttavia, le tecnologie ad alta risoluzione e un numero emergente di modelli di cellule staminali embrionali 1,2 rivelano un’eterogeneità senza precedenti tra gli strati germinali precoci 3,4. Ciò suggerisce che resta ancora molto da scoprire sui meccanismi che regolano le distinte popolazioni cellulari della gastrula. Lo sviluppo embrionale del topo è stato uno dei migliori modelli per studiare le prime decisioni sul destino cellulare durante la gastrulazione 3,5. La gastrulazione nei topi è rapida, poiché l’intero processo di gastrulazione avviene entro 48 ore, dal giorno embrionale E6.5 a E85.
I recenti progressi nelle tecnologie a singola cellula hanno permesso una mappatura dettagliata dello sviluppo embrionale di topo wild-type, fornendo una panoramica completa dei paesaggi cellulari e molecolari degli embrioni durante la gastrulazione 3,4,6,7,8. Tuttavia, l’analisi degli embrioni mutanti in queste fasi è meno comune e spesso limitata alle popolazioni selezionate FACS 9,10. La scarsa letteratura riflette le sfide tecniche associate alla manipolazione e alla preparazione di singole cellule di embrioni gastrulanti che richiedono la genotipizzazione. Catturare il processo dinamico di gastrulazione può rappresentare una sfida a causa della sua natura rapida, soprattutto per la comprensione degli embrioni mutanti. La tempistica e la sincronizzazione delle gravidanze sono essenziali, poiché anche lievi differenze tra le gravidanze programmate possono essere interpretate erroneamente come un fenotipo di sviluppo derivante dal gene mutante. Ciò diventa particolarmente importante quando il gene mutante influenza il processo di gastrulazione 13,14. In questo studio, vengono stabilite le linee guida per ottenere gravidanze sincronizzate attraverso la visualizzazione dei tappi vaginali (cioè la massa di liquido seminale coagulato formata nella vagina della femmina dopo l’accoppiamento). Inoltre, è stata progettata una strategia per ottenere dati solidi su singole cellule da embrioni gastrulanti mutanti da E6.5 a E8. Questa strategia è stata ideata per superare i vincoli associati al basso numero di embrioni con il genotipo desiderato per gravidanza e alla diminuzione della vitalità causata dal congelamento-scongelamento di embrioni o cellule.
Questo articolo descrive una metodologia ottimizzata dall’instaurazione di gravidanze temporizzate tramite tappi vaginali al sequenziamento finale di singole cellule/nuclei. Questo metodo spiega come aumentare il numero di gravidanze sincronizzate per ottenere un numero maggiore di embrioni con il genotipo desiderato, isolamenti di cellule/nuclei per migliorare la vitalità delle cellule e un protocollo di genotipizzazione in giornata. Questo manoscritto descrive anche il processo di isolamento dell’embrione in diversi punti temporali della gastrulazione. La metodologia aiuta ad aumentare il numero di cellule/nuclei embrionali vitali finali per il sequenziamento, garantendo dati di sequenziamento di alta qualità. Pertanto, questo metodo aprirà le porte a studi su singole cellule di embrioni gastrulanti che richiedono la genotipizzazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo viene presentata una robusta pipeline per ottenere sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità da embrioni di topo gastrulanti, specificamente progettata per facilitare gli studi sui meccanismi di specificazione del destino cellulare nelle prime fasi di sviluppo. Questo metodo affronta una lacuna cruciale nel campo della gastrulazione ottimizzando l’analisi degli embrioni che richiedono genotipi, come il sesso o i geni somatici. Utilizzando modelli murini di mutazione genetica e impiegando…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Genomics Core del Fox Chase Cancer Center e i membri del laboratorio del Dr. Johnathan Whetstine Zach Gray, Madison Honer e Benjamin Ferman per il supporto tecnico per gli esperimenti di sequenziamento. Ringraziamo i membri del laboratorio del Dr. Estaras e Alex Morris, uno studente laureato a rotazione che ha contribuito all’analisi iniziale degli studi su singole cellule. Questo lavoro è finanziato dalle sovvenzioni NIH R01HD106969 e R56HL163146 a Conchi Estaras. Inoltre, Elizabeth Abraham è stata supportata dalla sovvenzione di formazione T32 5T32HL091804-12.
Materials
| 10 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 1000 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 23-430 | |
| 20 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-404 | |
| 300 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-415 | |
| 37 µm Reversible Strainer, small | Stem Cell | 27215 | |
| 6 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-260 | |
| 8-strip PCR tubes | Genesee Scientific | 27-125U | |
| Agarose | Apex Bioresearch Product | 20-102 | |
| Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath | Genesee | 31-437 | |
| Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge | Genesee | 33-759R | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Chromium Controller | 10X | PN-1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X | PN-1000269 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Couning Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Digitonin | ThermoFisher Scientific | BN2006 | |
| DirectPCR yolk sac | Viagen | 201-Y | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x) | CORNING | 10-013-CV | |
| Dulbecco's PBS | GenClone | 25-508 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol | Koptec | V1401 | |
| EVOS M7000 Imaging System | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| GoTaq G2 Green Master Mix | Promega | M7823 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| MgCl2 | ThermoFisher Scientific | AC223211000 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 | Illumina | 20046811 | |
| NextSeq2000 | Illumina | ||
| Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope | Nikon | ||
| Nondiedt P40 | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free Water | GenClone | 25-511 | |
| Optical Tube 8x Strip (401428) | Agilent | 401428 | |
| Optical Tube Cap 8x Strip (401425) | Agilent | 401425 | |
| Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit | Genesee | 31-511 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| Qubit dsDNA Quantification Assay Kits | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit Flex 3 | Invitrogen | ||
| RNase inhibitor | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Tape Station Loading tips | Agilent | 5067-5598 | |
| Tapestation 4150 | Agilent | G2992AA | |
| Tris-HCL (Ph7) | Quality Biological | 351-007-101 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Theromo Fisher Scientific | T10282 | |
| Tryple Express | Gibco | 12604-021 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter | IKA | 3617000 |
References
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