ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה
Summary
מאמר זה קובע צינור להשעיה איכותית של תאים בודדים וגרעינים של עוברי עכברים גסטרולטיביים לצורך ריצוף של תאים בודדים וגרעינים.
Abstract
במהלך העשור האחרון, גישות חד-תאיות הפכו לתקן הזהב לחקר דינמיקה של ביטוי גנים, הטרוגניות של תאים ומצבי תאים בתוך דגימות. לפני התקדמות התא הבודד, ההיתכנות של לכידת הנוף התאי הדינמי ומעברי תאים מהירים במהלך ההתפתחות המוקדמת הייתה מוגבלת. במאמר זה, צינור חזק תוכנן לבצע אנליזה של תאים בודדים וגרעינים על עוברי עכברים מהיום העוברי E6.5 עד E8, המתאים לתחילת והשלמת הגסטרולציה. גסטרולציה היא תהליך בסיסי במהלך הפיתוח הקובע את שלוש שכבות הנבט: מזודרם, אקטודרם ואנדודרם, החיוניים לאורגנוגנזה. קיימת ספרות נרחבת על אומיקה חד-תאית המיושמת על עוברי פריגסטרולציה מסוג פראי. עם זאת, ניתוח חד-תאי של עוברים מוטנטיים עדיין נדיר ולעתים קרובות מוגבל לאוכלוסיות ממוינות FACS. זאת, בין היתר, בשל האילוצים הטכניים הקשורים לצורך בגנוטיפ, הריונות מתוזמנים, ספירת עוברים עם גנוטיפים רצויים להריון ומספר התאים לעובר בשלבים אלה. כאן מוצגת מתודולוגיה שנועדה להתגבר על מגבלות אלה. שיטה זו קובעת הנחיות רבייה והריון מתוזמן כדי להשיג סיכוי גבוה יותר להריונות מסונכרנים עם גנוטיפים רצויים. שלבי אופטימיזציה בתהליך בידוד העובר יחד עם פרוטוקול גנוטיפ באותו יום (3 שעות) מאפשרים לבצע תא בודד מבוסס מיקרו-טיפות באותו יום, מה שמבטיח את הכדאיות הגבוהה של התאים ותוצאות חזקות. שיטה זו כוללת גם הנחיות לבידודים אופטימליים של גרעינים מעוברים. לפיכך, גישות אלה מגדילות את ההיתכנות של גישות חד-תאיות של עוברים מוטנטיים בשלב הגסטרולציה. אנו צופים כי שיטה זו תקל על ניתוח האופן שבו מוטציות מעצבות את הנוף התאי של הגסטרולה.
Introduction
גסטרולציה היא תהליך בסיסי הנדרש להתפתחות תקינה. תהליך מהיר ודינמי זה מתרחש כאשר תאים פלוריפוטנטיים עוברים למבשרים ספציפיים לשושלת המגדירים כיצד נוצרים איברים. במשך שנים, גסטרולציה הוגדרה זמן רב כהיווצרות של שלוש אוכלוסיות הומוגניות ברובן: מזודרם, אקטודרם ואנדודרם. עם זאת, טכנולוגיות ברזולוציה גבוהה ומספר מתפתח של מודלים של תאי גזע עובריים 1,2 חושפים הטרוגניות חסרת תקדים בין שכבות הנבט המוקדמות 3,4. זה מצביע על כך שנותר עוד הרבה מה לגלות על המנגנונים המווסתים את אוכלוסיות התאים השונות של הגסטרולה. התפתחות עוברית של עכבר הייתה אחד המודלים הטובים ביותר לחקר החלטות מוקדמות לגבי גורל התא במהלך גסטרולציה 3,5. הגסטרולציה בעכברים היא מהירה, שכן כל תהליך הגסטרולציה מתרחש תוך 48 שעות, מהיום העוברי E6.5 עד E85.
ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות של תא בודד אפשרה מיפוי מפורט של התפתחות עוברי עכבר מסוג פרא, וסיפקה סקירה מקיפה של הנוף התאי והמולקולרי של עוברים במהלך גסטרולציה 3,4,6,7,8. עם זאת, ניתוח עוברים מוטנטיים בשלבים אלה הוא פחות נפוץ ולעתים קרובות מוגבל לאוכלוסיות ממוינות FAC 9,10. הספרות המועטה משקפת את האתגרים הטכניים הקשורים למניפולציה והכנה חד-תאית של עוברים גסטרולטיביים הדורשים גנוטיפ. לכידת התהליך הדינמי של גסטרולציה יכולה להציב אתגרים בשל טבעו המהיר, במיוחד להבנת עוברים מוטנטיים. העיתוי והסנכרון של הריונות הם חיוניים, שכן אפילו הבדלים קלים בין הריונות מתוזמנים יכולים להתפרש בטעות כפנוטיפ התפתחותי הנובע מהגן המוטנטי. זה הופך להיות חשוב במיוחד כאשר הגן המוטנטי משפיע על תהליך הגסטרולציה13,14. במחקר זה, נקבעו קווים מנחים להשגת הריונות מסונכרנים באמצעות הדמיה של פקקים בנרתיק (כלומר, מסת נוזל הזרע הקרוש שנוצר בנרתיק הנקבה לאחר ההזדווגות). בנוסף, אסטרטגיה נועדה להשיג נתונים חד-תאיים חזקים מעוברים מוטנטיים מ-E6.5 עד E8. אסטרטגיה זו פותחה כדי להתגבר על אילוצים הקשורים למספר הנמוך של עוברים עם הגנוטיפ הרצוי להריון ולירידה בכדאיות הנגרמת על ידי הקפאה-הפשרה של עוברים או תאים.
מאמר זה מתאר מתודולוגיה אופטימלית החל מקביעת הריונות מתוזמנים דרך פקקים וגינליים ועד לריצוף הסופי של תאים/גרעינים בודדים. שיטה זו מסבירה כיצד להגדיל את מספר ההריונות המסונכרנים כדי להשיג מספר גבוה יותר של עוברים עם גנוטיפ רצוי, בידודי תאים/גרעינים כדי לשפר את יכולת הקיום של התאים, ופרוטוקול גנוטיפ באותו יום. כתב יד זה מתאר גם את תהליך בידוד העוברים בנקודות זמן שונות של גסטרולציה. המתודולוגיה מסייעת להגדיל את מספר תאי העובר/גרעינים הסופיים ברי קיימא לריצוף, ומבטיחה נתוני ריצוף באיכות גבוהה. לכן, שיטה זו תפתח את הדלתות למחקרים חד-תאיים של עוברים גסטרולטיביים הדורשים גנוטיפ.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה מוצג צינור איתן להשגת תרחיפים חד-תאיים וגרעינים באיכות גבוהה מעוברי עכברים מגזימים, שתוכננו במיוחד כדי להקל על מחקרים על מנגנונים של אפיון גורל התא בהתפתחות מוקדמת. שיטה זו מטפלת בפער מכריע בתחום הגסטרולציה על ידי אופטימיזציה של ניתוח עוברים הדורשים גנוטיפים, כגון מין או גנים סו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לליבת הגנומיקה במרכז הסרטן פוקס צ’ייס ולד”ר ג’ונתן ווטסטין ולחברי המעבדה זאק גריי, מדיסון הונר ובנג’מין פרמן על התמיכה הטכנית בניסויי הריצוף. אנו מודים לחברי המעבדה של ד”ר אסטרס ואלכס מוריס, סטודנט לתואר שני ברוטציה שתרמו לניתוח הראשוני של המחקרים החד-תאיים. עבודה זו ממומנת על ידי מענקי NIH R01HD106969 R56HL163146 לקונצ’י אסטראס. בנוסף, אליזבת אברהם נתמכה על ידי מענק הכשרה T32 5T32HL091804-12.
Materials
| 10 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 1000 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 23-430 | |
| 20 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-404 | |
| 300 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-415 | |
| 37 µm Reversible Strainer, small | Stem Cell | 27215 | |
| 6 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-260 | |
| 8-strip PCR tubes | Genesee Scientific | 27-125U | |
| Agarose | Apex Bioresearch Product | 20-102 | |
| Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath | Genesee | 31-437 | |
| Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge | Genesee | 33-759R | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Chromium Controller | 10X | PN-1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X | PN-1000269 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Couning Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Digitonin | ThermoFisher Scientific | BN2006 | |
| DirectPCR yolk sac | Viagen | 201-Y | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x) | CORNING | 10-013-CV | |
| Dulbecco's PBS | GenClone | 25-508 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol | Koptec | V1401 | |
| EVOS M7000 Imaging System | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| GoTaq G2 Green Master Mix | Promega | M7823 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| MgCl2 | ThermoFisher Scientific | AC223211000 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 | Illumina | 20046811 | |
| NextSeq2000 | Illumina | ||
| Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope | Nikon | ||
| Nondiedt P40 | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free Water | GenClone | 25-511 | |
| Optical Tube 8x Strip (401428) | Agilent | 401428 | |
| Optical Tube Cap 8x Strip (401425) | Agilent | 401425 | |
| Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit | Genesee | 31-511 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| Qubit dsDNA Quantification Assay Kits | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit Flex 3 | Invitrogen | ||
| RNase inhibitor | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Tape Station Loading tips | Agilent | 5067-5598 | |
| Tapestation 4150 | Agilent | G2992AA | |
| Tris-HCL (Ph7) | Quality Biological | 351-007-101 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Theromo Fisher Scientific | T10282 | |
| Tryple Express | Gibco | 12604-021 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter | IKA | 3617000 |
References
- Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
- Kim, Y., Kim, I., Shin, K. A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond: from blastoids to synthetic embryos and beyond. Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).
- Pijuan-Sala, B., et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).
- Mittnenzweig, M., et al. A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation. Cell. 184 (11), P2825-P2842.E22 (2021).
- Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate. Mech Dev. 163, 103617 (2020).
- Argelaguet, R., et al. Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution. Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- Mohammed, H., et al. Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation. Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).
- Lescroart, F., et al. Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq. Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).
- Scialdone, A., et al. Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling. Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).
- . 10X Genomics. Chromium Next GEM single cell 3′ reagent kits v3.1: User guide Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry (2024)
- . NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol Available from: https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm (2024)
- Dai, H. Q., et al. TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling. Nature. 538, 528-532 (2016).
- Li, Q., et al. Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation. Nat Commun. 14 (1), 2922 (2023).
- Saga, Y., et al. MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube. Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Mol Cell. 65 (4), 631-643.e4 (2017).
.