Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Die Gastrulation ist ein grundlegender Prozess, der für die normale Entwicklung erforderlich ist. Dieser schnelle und dynamische Prozess tritt auf, wenn pluripotente Zellen in linienspezifische Vorläufer übergehen, die die Organbildung definieren. Jahrelang wurde Gastrulation lange Zeit als die Bildung von drei weitgehend homogenen Populationen definiert: Mesoderm, Ektoderm und Endoderm. Hochauflösende Technologien und eine neue Anzahl embryonaler Stammzellmodelle ^1,2 offenbaren jedoch eine noch nie dagewesene Heterogenität unter den frühen Keimblättern ^3,4. Dies deutet darauf hin, dass über die Mechanismen, die die unterschiedlichen Zellpopulationen der Gastrula regulieren, noch viel mehr geklärt werden muss. Die Embryonalentwicklung von Mäusen war eines der besten Modelle, um frühe Entscheidungen über das Schicksal von Zellen während der Gastrulation^{zu untersuchen 3,5}. Die Gastrulation bei Mäusen ist schnell, da der gesamte Prozess der Gastrulation innerhalb von 48 Stunden vom Embryonaltag E6.5 bis E8⁵ stattfindet.

Jüngste Fortschritte in der Einzelzelltechnologie haben eine detaillierte Kartierung der Embryonalentwicklung von Wildtyp-Mäusen ermöglicht und einen umfassenden Überblick über die zellulären und molekularen Landschaften von Embryonen während der Gastrulation gegeben 3,4,6,7,8. Die Analyse mutierter Embryonen in diesen Stadien ist jedoch weniger verbreitet und oft auf FACS-sortierte Populationen beschränkt ^9,10. Die spärliche Literatur spiegelt die technischen Herausforderungen wider, die mit der Manipulation und Einzelzellpräparation von gastrulierenden Embryonen verbunden sind, die eine Genotypisierung erfordern. Die Erfassung des dynamischen Prozesses der Gastrulation kann aufgrund seiner Schnelligkeit eine Herausforderung darstellen, insbesondere für das Verständnis mutierter Embryonen. Der Zeitpunkt und die Synchronisation von Schwangerschaften sind von entscheidender Bedeutung, da bereits geringe Unterschiede zwischen zeitlich begrenzten Schwangerschaften als Entwicklungsphänotyp fehlinterpretiert werden können, der aus dem mutierten Gen resultiert. Dies ist besonders wichtig, wenn das mutierte Gen den Prozess der Gastrulation beeinflusst^13,14. In dieser Studie werden Richtlinien aufgestellt, um synchronisierte Schwangerschaften durch Visualisierung von Vaginalplugs (d.h. der Masse der geronnenen Samenflüssigkeit, die sich nach der Paarung in der Vagina des Weibchens bildet) zu erhalten. Darüber hinaus wird eine Strategie entwickelt, um robuste Einzelzelldaten von mutierten gastrulierenden Embryonen von E6.5 bis E8 zu erhalten. Diese Strategie wurde entwickelt, um die Einschränkungen zu überwinden, die mit der geringen Anzahl von Embryonen mit dem gewünschten Genotyp pro Schwangerschaft und der Abnahme der Lebensfähigkeit durch das Einfrieren und Auftauen von Embryonen oder Zellen verbunden sind.

In dieser Arbeit wird eine optimierte Methodik von der Etablierung zeitgesteuerter Schwangerschaften über Vaginalplugs bis hin zur abschließenden Sequenzierung einzelner Zellen/Zellkerne beschrieben. Diese Methode erklärt, wie die Anzahl der synchronisierten Schwangerschaften erhöht werden kann, um eine höhere Anzahl von Embryonen mit dem gewünschten Genotyp zu erhalten, Zell-/Zellkernisolierungen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern, und ein Genotypisierungsprotokoll am selben Tag. Dieses Manuskript beschreibt auch den Prozess der Embryoisolierung zu verschiedenen Gastrulationszeitpunkten. Die Methodik trägt dazu bei, die Anzahl der endgültigen lebensfähigen embryonalen Zellen/Zellkerne für die Sequenzierung zu erhöhen und so qualitativ hochwertige Sequenzierungsdaten zu gewährleisten. Daher wird diese Methode die Türen für Einzelzellstudien an gastrulierenden Embryonen öffnen, die eine Genotypisierung erfordern.