Séquençage de l’ARN unicellulaire d’embryons entiers de souris mutantes : de l’épiblaste à la fin de la gastrulation

La gastrulation est un processus fondamental nécessaire au développement normal. Ce processus rapide et dynamique se produit lorsque les cellules pluripotentes se transforment en précurseurs spécifiques à la lignée qui définissent la formation des organes. Pendant des années, la gastrulation a longtemps été définie comme la formation de trois populations largement homogènes : le mésoderme, l’ectoderme et l’endoderme. Cependant, les technologies à haute résolution et un nombre émergent de modèles de cellules souches embryonnaires ^1,2 révèlent une hétérogénéité sans précédent parmi les couches germinales précoces ^3,4. Cela suggère qu’il reste encore beaucoup à découvrir sur les mécanismes régulant les populations cellulaires distinctes de la gastrula. Le développement embryonnaire de souris a été l’un des meilleurs modèles pour étudier les décisions précoces du destin cellulaire pendant la gastrulation ^3,5. La gastrulation chez la souris est rapide, car l’ensemble du processus de gastrulation se produit dans les 48 heures, du jour embryonnaire E6.5 à E8⁵.

Les progrès récents des technologies unicellulaires ont permis une cartographie détaillée du développement embryonnaire de souris de type sauvage, fournissant un aperçu complet des paysages cellulaires et moléculaires des embryons pendant la gastrulation 3,4,6,7,8. Cependant, l’analyse des embryons mutants à ces stades est moins fréquente et souvent limitée aux populations triées par FACS ^9,10. La rareté de la littérature reflète les défis techniques associés à la manipulation et à la préparation de cellules uniques d’embryons gastrulants qui nécessitent un génotypage. La capture du processus dynamique de gastrulation peut poser des défis en raison de sa nature rapide, en particulier pour comprendre les embryons mutants. Le moment et la synchronisation des grossesses sont essentiels, car même de légères différences entre les grossesses programmées peuvent être interprétées à tort comme un phénotype développemental résultant du gène mutant. Cela devient particulièrement important lorsque le gène mutant influence le processus de gastrulation^13,14. Dans cette étude, des lignes directrices sont établies pour obtenir des grossesses synchronisées par la visualisation des bouchons vaginaux (c’est-à-dire la masse de liquide séminal coagulé formée dans le vagin de la femelle après l’accouplement). De plus, une stratégie est conçue pour obtenir des données unicellulaires robustes à partir d’embryons gastrulants mutants de E6.5 à E8. Cette stratégie est conçue pour surmonter les contraintes liées au faible nombre d’embryons avec le génotype souhaité par grossesse et à la diminution de la viabilité causée par la congélation-décongélation d’embryons ou de cellules.

Cet article décrit une méthodologie optimisée depuis l’établissement de grossesses programmées via des bouchons vaginaux jusqu’au séquençage final de cellules uniques/noyaux. Cette méthode explique comment augmenter le nombre de grossesses synchronisées pour obtenir un plus grand nombre d’embryons avec le génotype souhaité, des isolements de cellules/noyaux pour améliorer la viabilité des cellules et un protocole de génotypage le jour même. Ce manuscrit décrit également le processus d’isolement des embryons à différents points temporels de la gastrulation. La méthodologie permet d’augmenter le nombre de cellules/noyaux embryonnaires viables finaux pour le séquençage, garantissant ainsi des données de séquençage de haute qualité. Par conséquent, cette méthode ouvrira la porte à des études unicellulaires d’embryons gaztrulants nécessitant un génotypage.