Single-cell RNA-sequencing van gemuteerde hele muizenembryo's: van de epiblast tot het einde van de gastrulatie

Gastrulatie is een fundamenteel proces dat nodig is voor een normale ontwikkeling. Dit snelle en dynamische proces vindt plaats wanneer pluripotente cellen overgaan in afstammingsspecifieke voorlopers die bepalen hoe organen worden gevormd. Jarenlang werd gastrulatie lang gedefinieerd als de vorming van drie grotendeels homogene populaties: mesoderm, ectoderm en endoderm. Technologieën met een hoge resolutie en een opkomend aantal embryonale stamcelmodellen ^1,2 onthullen echter een ongekende heterogeniteit tussen de vroege kiemlagen ^3,4. Dit suggereert dat er nog veel meer moet worden ontdekt over de mechanismen die de verschillende celpopulaties van de gastrula reguleren. De embryonale ontwikkeling van muizen is een van de beste modellen geweest om vroege beslissingen over het lot van cellen tijdens gastrulatie te bestuderen ^3,5. Gastrulatie bij muizen is snel, aangezien het hele proces van gastrulatie binnen 48 uur plaatsvindt, van embryonale dag E6.5 tot E8⁵.

Recente ontwikkelingen in eencellige technologieën hebben het mogelijk gemaakt om de embryonale ontwikkeling van wildtype muizen gedetailleerd in kaart te brengen, waardoor een uitgebreid overzicht wordt gegeven van de cellulaire en moleculaire landschappen van embryo’s tijdens gastrulatie 3,4,6,7,8. De analyse van mutante embryo’s in deze stadia komt echter minder vaak voor en is vaak beperkt tot FACS-gesorteerde populaties ^9,10. De schaarse literatuur weerspiegelt de technische uitdagingen die gepaard gaan met de manipulatie en eencellige voorbereiding van gastrulerende embryo’s die genotypering vereisen. Het vastleggen van het dynamische proces van gastrulatie kan uitdagingen opleveren vanwege de snelle aard ervan, vooral voor het begrijpen van mutante embryo’s. De timing en synchronisatie van zwangerschappen zijn essentieel, omdat zelfs kleine verschillen tussen getimede zwangerschappen verkeerd kunnen worden geïnterpreteerd als een ontwikkelingsfenotype dat het gevolg is van het gemuteerde gen. Dit wordt vooral belangrijk wanneer het gemuteerde gen het proces van gastrulatie beïnvloedt^13,14. In deze studie worden richtlijnen opgesteld om gesynchroniseerde zwangerschappen te verkrijgen door visualisatie van vaginale pluggen (d.w.z. de massa gecoaguleerde zaadvloeistof die na de paring in de vagina van het vrouwtje wordt gevormd). Daarnaast is er een strategie ontworpen om robuuste eencellige gegevens te verkrijgen van mutante gastrulerende embryo’s van E6.5 tot E8. Deze strategie is ontworpen om de beperkingen te overwinnen die verband houden met het lage aantal embryo’s met het gewenste genotype per zwangerschap en de afname van de levensvatbaarheid veroorzaakt door het invriezen en ontdooien van embryo’s of cellen.

Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde methodologie van het tot stand brengen van getimede zwangerschappen via vaginale pluggen tot de uiteindelijke sequentiebepaling van individuele cellen/kernen. Deze methode legt uit hoe het aantal gesynchroniseerde zwangerschappen kan worden verhoogd om een groter aantal embryo’s met het gewenste genotype te verkrijgen, cel-/kernisolaties om de levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren en een genotyperingsprotocol op dezelfde dag. Dit manuscript beschrijft ook het proces van embryo-isolatie op verschillende gastrulatietijdstippen. De methodologie helpt om het aantal uiteindelijk levensvatbare embryocellen/-kernen voor sequencing te verhogen, waardoor sequencinggegevens van hoge kwaliteit worden gegarandeerd. Daarom zal deze methode de deuren openen voor eencellige studies van gastrulerende embryo’s die genotypering vereisen.