تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة
Summary
تؤسس هذه الورقة خط أنابيب لمعلقات عالية الجودة للخلية المفردة والنوى لأجنة الفئران المعدة لتسلسل الخلايا المفردة والنوى.
Abstract
على مدى العقد الماضي ، أصبحت مناهج الخلية الواحدة المعيار الذهبي لدراسة ديناميكيات التعبير الجيني ، وعدم تجانس الخلايا ، وحالات الخلايا داخل العينات. قبل تقدم الخلية الواحدة ، كانت جدوى التقاط المشهد الخلوي الديناميكي والتحولات الخلوية السريعة أثناء التطور المبكر محدودة. في هذه الورقة ، تم تصميم خط أنابيب قوي لإجراء تحليل أحادي الخلية ونوى على أجنة الفئران من اليوم الجنيني E6.5 إلى E8 ، وهو ما يتوافق مع بداية واكتمال المعدة. المعدة هي عملية أساسية أثناء التطور تحدد الطبقات الجرثومية الثلاث: الأديم المتوسط ، والأديم الظاهر ، والأديم الباطن ، والتي تعتبر ضرورية لتكوين الأعضاء. تتوفر أدبيات واسعة النطاق حول omics أحادية الخلية المطبقة على الأجنة المحيطة بالمعدة من النوع البري. ومع ذلك ، لا يزال تحليل الخلية الواحدة للأجنة الطافرة نادرا وغالبا ما يقتصر على المجموعات التي تم فرزها بواسطة FACS. ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود التقنية المرتبطة بالحاجة إلى التنميط الجيني ، والحمل الموقوت ، وعدد الأجنة ذات الأنماط الجينية المرغوبة لكل حمل ، وعدد الخلايا لكل جنين في هذه المراحل. هنا ، يتم تقديم منهجية مصممة للتغلب على هذه القيود. تضع هذه الطريقة إرشادات للتكاثر والحمل الموقوت لتحقيق فرصة أكبر للحمل المتزامن مع الأنماط الجينية المرغوبة. تسمح خطوات التحسين في عملية عزل الجنين إلى جانب بروتوكول التنميط الجيني في نفس اليوم (3 ساعات) بإجراء خلية مفردة قائمة على القطرات الدقيقة في نفس اليوم ، مما يضمن قابلية عالية للبقاء ونتائج قوية. تتضمن هذه الطريقة أيضا إرشادات لعزل النوى الأمثل عن الأجنة. وبالتالي ، فإن هذه الأساليب تزيد من جدوى نهج الخلية الواحدة للأجنة الطافرة في مرحلة المعدة. نتوقع أن تسهل هذه الطريقة تحليل كيفية تشكيل الطفرات للمشهد الخلوي للمعدة.
Introduction
المعدة هي عملية أساسية مطلوبة للتطور الطبيعي. تحدث هذه العملية السريعة والديناميكية عندما تنتقل الخلايا متعددة القدرات إلى سلائف خاصة بالنسب تحدد كيفية تكوين الأعضاء. لسنوات ، تم تعريف المعدة منذ فترة طويلة على أنها تكوين ثلاث مجموعات متجانسة إلى حد كبير: الأديم المتوسط ، والأديم الظاهر ، والأديم الباطن. ومع ذلك ، فإن التقنيات عالية الدقة والعدد الناشئ من نماذج الخلايا الجذعية الجنينية 1,2 تكشف النقاب عن عدم تجانس غير مسبوق بين طبقات الجراثيم المبكرة 3,4. هذا يشير إلى أنه لا يزال هناك الكثير الذي يجب الكشف عنه حول الآليات التي تنظم مجموعات الخلايا المتميزة في المعدة. كان التطور الجنيني للفأر أحد أفضل النماذج لدراسة قرارات مصير الخلية المبكرة أثناء المعدة 3,5. المعدة في الفئران سريعة ، حيث تحدث عملية المعدة بأكملها في غضون 48 ساعة ، من اليوم الجنيني E6.5 إلى E85.
مكنت التطورات الحديثة في تقنيات الخلية الواحدة من رسم خرائط مفصلة للتطور الجنيني للفأر من النوع البري ، مما يوفر نظرة عامة شاملة على المناظر الطبيعية الخلوية والجزيئية للأجنة أثناء عملية المعدة3،4،6،7،8. ومع ذلك ، فإن تحليل الأجنة الطافرة في هذه المراحل أقل شيوعا وغالبا ما يقتصر على المجموعات المصنفةمن قبل FACS 9,10. تعكس الأدبيات النادرة التحديات التقنية المرتبطة بالتلاعب وإعداد خلية واحدة للأجنة المعدة التي تتطلب التنميط الجيني. يمكن أن يشكل التقاط العملية الديناميكية للمعدة تحديات بسبب طبيعتها السريعة ، خاصة لفهم الأجنة الطافرة. يعد توقيت الحمل وتزامنه أمرا ضروريا ، حيث يمكن إساءة تفسير الاختلافات الطفيفة بين حالات الحمل الموقوتة على أنها نمط ظاهري تنموي ناتج عن الجين الطافر. يصبح هذا مهما بشكل خاص عندما يؤثر الجين الطافر على عملية المعدة13,14. في هذه الدراسة ، تم وضع مبادئ توجيهية للحصول على حالات الحمل المتزامن من خلال تصور المقابس المهبلية (أي كتلة السائل المنوي المتخثر المتشكل في مهبل الأنثى بعد التزاوج). بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم استراتيجية للحصول على بيانات قوية أحادية الخلية من أجنة المعدة الطافرة من E6.5 إلى E8. تم تصميم هذه الاستراتيجية للتغلب على القيود المرتبطة بانخفاض عدد الأجنة ذات النمط الجيني المرغوب فيه لكل حمل وانخفاض القدرة على البقاء الناجم عن تجميد الأجنة أو الخلايا.
تصف هذه الورقة منهجية محسنة من إنشاء حالات الحمل الموقوتة عبر سدادات المهبل إلى التسلسل النهائي للخلايا / النوى المفردة. تشرح هذه الطريقة كيفية زيادة عدد حالات الحمل المتزامن للحصول على عدد أكبر من الأجنة ذات النمط الجيني المطلوب ، وعزل الخلايا / النوى لتحسين صلاحية الخلايا ، وبروتوكول التنميط الجيني في نفس اليوم. تصف هذه المخطوطة أيضا عملية عزل الجنين في نقاط زمنية مختلفة للمعدة. تساعد المنهجية على زيادة عدد الخلايا / النوى الجنينية النهائية القابلة للحياة للتسلسل ، مما يضمن بيانات تسلسل عالية الجودة. لذلك ، ستفتح هذه الطريقة الأبواب أمام دراسات الخلية الواحدة للأجنة المعدية التي تتطلب التنميط الجيني.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تقديم خط أنابيب قوي في هذه الورقة للحصول على معلقات عالية الجودة للخلية الواحدة والنوى من أجنة الفئران المعدة ، المصممة خصيصا لتسهيل الدراسات حول آليات تحديد مصير الخلية في التطور المبكر. تعالج هذه الطريقة فجوة حاسمة في مجال المعدة من خلال تحسين تحليل الأجنة التي تتطلب أنماطا وراثية ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بمركز الجينوم الأساسي في مركز فوكس تشيس للسرطان وأعضاء مختبر الدكتور جوناثان ويتستين زاك جراي وماديسون هونر وبنيامين فيرمان للدعم الفني لتجارب التسلسل. نحن نعترف بأعضاء المختبر للدكتور إستاراس وأليكس موريس ، وهو طالب دراسات عليا مناوب ساهم في التحليل الأولي لدراسات الخلية الواحدة. يتم تمويل هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01HD106969 و R56HL163146 إلى Conchi Estaras. بالإضافة إلى ذلك ، تم دعم إليزابيث أبراهام من خلال منحة تدريب T32 5T32HL091804-12.
Materials
| 10 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 1000 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 23-430 | |
| 20 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-404 | |
| 300 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-415 | |
| 37 µm Reversible Strainer, small | Stem Cell | 27215 | |
| 6 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-260 | |
| 8-strip PCR tubes | Genesee Scientific | 27-125U | |
| Agarose | Apex Bioresearch Product | 20-102 | |
| Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath | Genesee | 31-437 | |
| Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge | Genesee | 33-759R | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Chromium Controller | 10X | PN-1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X | PN-1000269 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Couning Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Digitonin | ThermoFisher Scientific | BN2006 | |
| DirectPCR yolk sac | Viagen | 201-Y | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x) | CORNING | 10-013-CV | |
| Dulbecco's PBS | GenClone | 25-508 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol | Koptec | V1401 | |
| EVOS M7000 Imaging System | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| GoTaq G2 Green Master Mix | Promega | M7823 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| MgCl2 | ThermoFisher Scientific | AC223211000 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 | Illumina | 20046811 | |
| NextSeq2000 | Illumina | ||
| Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope | Nikon | ||
| Nondiedt P40 | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free Water | GenClone | 25-511 | |
| Optical Tube 8x Strip (401428) | Agilent | 401428 | |
| Optical Tube Cap 8x Strip (401425) | Agilent | 401425 | |
| Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit | Genesee | 31-511 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| Qubit dsDNA Quantification Assay Kits | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit Flex 3 | Invitrogen | ||
| RNase inhibitor | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Tape Station Loading tips | Agilent | 5067-5598 | |
| Tapestation 4150 | Agilent | G2992AA | |
| Tris-HCL (Ph7) | Quality Biological | 351-007-101 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Theromo Fisher Scientific | T10282 | |
| Tryple Express | Gibco | 12604-021 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter | IKA | 3617000 |
References
- Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
- Kim, Y., Kim, I., Shin, K. A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond: from blastoids to synthetic embryos and beyond. Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).
- Pijuan-Sala, B., et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).
- Mittnenzweig, M., et al. A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation. Cell. 184 (11), P2825-P2842.E22 (2021).
- Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate. Mech Dev. 163, 103617 (2020).
- Argelaguet, R., et al. Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution. Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- Mohammed, H., et al. Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation. Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).
- Lescroart, F., et al. Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq. Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).
- Scialdone, A., et al. Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling. Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).
- . 10X Genomics. Chromium Next GEM single cell 3′ reagent kits v3.1: User guide Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry (2024)
- . NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol Available from: https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm (2024)
- Dai, H. Q., et al. TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling. Nature. 538, 528-532 (2016).
- Li, Q., et al. Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation. Nat Commun. 14 (1), 2922 (2023).
- Saga, Y., et al. MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube. Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Mol Cell. 65 (4), 631-643.e4 (2017).
.