Fare Beyninden ve Kafatasından İmmün Hücrelerin İzole Edilmesi
Summary
Beyin bozukluklarına karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için yaygın bir yaklaşım, bağışıklık hücrelerindeki değişiklikleri analiz etmektir. Burada, murin beyin dokusu ve kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerini izole etmek için iki basit ve etkili protokol sağlanmıştır.
Abstract
Artan kanıtlar, beyin bozukluklarının (örneğin, beyin iskemisi ve otoimmün ensefalomiyelit) tetiklediği bağışıklık tepkisinin sadece beyinde değil, aynı zamanda kafatasında da meydana geldiğini göstermektedir. Beyin hasarından sonra hem beyin hem de kafatası kemik iliğindeki bağışıklık hücresi popülasyonlarındaki değişiklikleri analiz etmeye yönelik önemli bir adım (ör., felç), aşağı akış analizleri için yeterli sayıda yüksek kaliteli bağışıklık hücresi elde etmektir. Burada, bağışıklık hücrelerini beyinden ve kafatası kemik iliğinden izole etmek için optimize edilmiş iki protokol sağlanmıştır. Her iki protokolün avantajları, basitlikleri, hızları ve büyük miktarda canlı bağışıklık hücresi elde etmedeki etkinliklerine yansır. Bu hücreler, hücre sıralama, akış sitometrisi ve transkriptomik analiz gibi bir dizi aşağı akış uygulaması için uygun olabilir. Protokollerin etkinliğini göstermek için, akış sitometrisi analizi kullanılarak inme beyinleri ve normal beyin kafatası kemik iliği üzerinde immünofenotip deneyleri yapıldı ve sonuçlar yayınlanmış çalışmalardan elde edilen bulgularla uyumlu hale getirildi.
Introduction
Sinir sisteminin merkezi merkezi olan beyin, kafatası tarafından korunur. Kafatasının altında meninksler olarak bilinen üç bağ dokusu tabakası vardır – dura mater, araknoid mater ve pia mater. Beyin omurilik sıvısı (BOS), araknoid mater ve pia mater arasındaki subaraknoid boşlukta dolaşır, beyni yastıklar ve ayrıca glifatik sistem 1,2 yoluyla atıkları uzaklaştırır. Birlikte, bu benzersiz mimari, beynin stabilitesini koruyan ve onu olası yaralanmalardan koruyan güvenli ve destekleyici bir ortam sağlar.
Beyin uzun zamandır bağışıklık ayrıcalığına sahip olarak kabul edildi. Bununla birlikte, artan kanıtlar, parankimdeki yerleşik mikrogliaya ek olarak, koroid pleksus ve meninksler de dahil olmak üzere beynin sınırlarının çok çeşitli bağışıklık hücrelerine ev sahipliği yaptığını gösterdiğinden, bu kavram kısmen terk edilmiştir3. Bu hücreler homeostazın korunmasında, beyin sağlığının izlenmesinde ve beyin hasarına karşı bağışıklık tepkisinin başlatılmasında kritik roller oynar. Özellikle, son bulgular kafatasının meninks bağışıklığında rol oynadığını ve yaralanma sonrası beyindeki bağışıklık tepkisine katkıda bulunabileceğini göstermektedir. 2018’de Herisson ve ark. kafatası kemik iliğini meninkslere bağlayan doğrudan vasküler kanalların ufuk açıcı bir keşfini yaptılarve böylece lökosit göçü için anatomik bir yol oluşturdular 4,5. Daha sonra Cugurra ve ark. meninkslerdeki birçok miyeloid hücrenin (örneğin monositler ve nötrofiller) ve B hücrelerinin kandan kaynaklanmadığını göstermiştir6. Yazarlar, kalvaria kemik flebi nakli ve seçici ışınlama rejimleri gibi teknikleri kullanarak, kafatası kemik iliğinin, CNS yaralanmasından sonra CNS parankiminin yanı sıra meninkslerdeki miyeloid hücreler için lokal bir kaynak olarak hizmet ettiğine dair ikna edici kanıtlar sağladılar6. Ayrıca, başka bir çalışma, meningeal B hücrelerinin sürekli olarak kafatası kemik iliği7 tarafından sağlandığını öne sürdü. Daha yakın zamanlarda, araknoid manşet çıkışı (ACE) olarak adlandırılan yeni bir yapı, bağışıklık hücresi kaçakçılığı için dura mater ile beyin arasında doğrudan bir geçit olarak tanımlanmıştır8.
Bu heyecan verici bulgular, bağışıklık hücrelerinin yaralı beyne sızmasının kökeni için önemli etkilere sahiptir (örneğin, iskemik inme sonrası). Çok sayıda kanıt, felçten sonra birçok bağışıklık hücresinin beyne sızdığını ve hem akut beyin hasarına hem de kronik beyin iyileşmesine katkıda bulunduğunu göstermiştir. Geleneksel fikir, bu hücrelerin beyne sızan kanda dolaşan lökositler olduğudur ve bu da büyük ölçüde inme kaynaklı kan-beyin bariyeri hasarı ile kolaylaştırılır. Ancak, bu fikre meydan okundu. Bir çalışmada, kafatasındaki ve farelerin tibiasındaki bağışıklık hücreleri farklı şekilde etiketlendi ve inmeden 6 saat sonra, kafatasında nötrofillerde ve monositlerde önemli ölçüde daha büyük bir azalma bulundu. iskemik beyinde tibia ve daha fazla kafatası kaynaklı nötrofil mevcuttu. Bu veriler, akut inme fazında, iskemik beyindeki nötrofillerin esas olarak kafatası kemik iliğindenkaynaklandığını göstermektedir 4. İlginç bir şekilde, CSF bu geçişe rehberlik edebilir. Gerçekten de, yakın tarihli iki rapor, BOS’un sinyal ipuçlarını beyinden kafatası kemik iliğine kafatası kanalları aracılığıyla doğrudan iletebildiğini ve CNS hasarından sonra kafatası kemik iliğinde hücre göçü ve hematopoez talimatı verebildiğini göstermiştir 9,10.
Bu son bulguların ışığında, beyin bozukluklarına karşı bağışıklık tepkisini incelerken, hem beyindeki hem de kafatası kemik iliğindeki bağışıklık hücrelerindeki değişiklikleri analiz etmek önemli hale gelmiştir. Bu tür araştırmalarda, hücre sıralama, akış sitometrisi analizi ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) gibi aşağı akış analizleri için yeterli sayıda yüksek kaliteli bağışıklık hücresine ihtiyaç vardır. Burada genel amaç, beyin dokusu ve kafatası kemik iliğinden tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için optimize edilmiş iki prosedür sunmaktır. Kafatasının kalvaryasının (frontal kemik, oksipital kemik ve parietal kemikler) tipik olarak kemik iliğini çıkarmak için kullanıldığını ve bu kemik iliğinin bu çalışma boyunca özellikle kafatası kemik iliği olarak adlandırıldığını belirtmek önemlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, beyin ve kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerini izole etmek için iki basit ama etkili protokol sunulmaktadır. Bu protokoller, özellikle akış sitometrisi olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamaları için uygun olabilecek büyük miktarda canlı bağışıklık hücresini güvenilir bir şekilde verebilir.
Çeşitli beyin bozukluklarında nöroinflamasyonu incelemek için, beyinden bağışıklık hücresi preparatları için birçok protokol oluşturulmuş…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mükemmel editoryal katkısı için Kathy Gage’e teşekkür ederiz. İllüstrasyon figürleri BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma, Anesteziyoloji Anabilim Dalı (Duke Üniversitesi Tıp Merkezi) ve NIH hibeleri NS099590, HL157354 ve NS127163 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 76332-066 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 76332-068 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| 18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305195 | |
| 1x HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| 96-well V-bottom microplate | SARSTEDT | 82.1583 | |
| AURORA flow cytometer | Cytek bioscience | ||
| BSA | Fisher | BP9706-100 | |
| CD11b-AF594 | BioLegend | 101254 | 1:500 dilution |
| CD19-BV785 | BioLegend | 115543 | 1:500 dilution |
| CD19-FITC | BioLegend | 115506 | 1:500 dilution |
| CD3-APC | BioLegend | 100312 | 1:500 dilution |
| CD3-PE | BioLegend | 100206 | 1:500 dilution |
| CD45-Alex 700 | BioLegend | 103128 | 1:500 dilution |
| CD45-BV421 | Biolegend | 103133 | 1:500 dilution |
| Cell Strainer 70 um | Avantor | 732-2758 | |
| Dressing Forceps | V. Mueller | NL1410 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fc Block | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| Forceps | Roboz | RS-5047 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | N7167 | 1:500 dilution |
| Ly6G-BV421 | BioLegend | 127628 | 1:500 dilution |
| Ly6G-PerCp-cy5.5 | BioLegend | 127615 | 1:500 dilution |
| NK1.1-APC-cy7 | BioLegend | 108723 | 1:500 dilution |
| Percoll (density gradient medium) | Cytiva | 17089101 | |
| Phosphate buffer saline (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | BioLegend | 420302 | |
| Scissors | SKLAR | 64-1250 | |
| WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size | DWK Life Sciences | 357544 |
References
- Bohr, T., et al. The glymphatic system: Current understanding and modeling. iScience. 25 (9), 104987 (2022).
- Jiang-Xie, L. F., et al. Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance. Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).
- Goertz, J. E., Garcia-Bonilla, L., Iadecola, C., Anrather, J. Immune compartments at the brain’s borders in health and neurovascular diseases. Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).
- Herisson, F., et al. Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration. Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).
- Mazzitelli, J. A., et al. Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system. Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).
- Cugurra, A., et al. Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma. Science. 373 (6553), eabf7844 (2021).
- Brioschi, S., et al. Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders. Science. 373 (6553), eabf9277 (2021).
- Smyth, L. C. D., et al. Identification of direct connections between the dura and the brain. Nature. 627, 165-173 (2024).
- Mazzitelli, J. A., et al. Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels. Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).
- Pulous, F. E., et al. Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis. Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).
- Li, R., et al. Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation. J Vis Exp. (194), e65340 (2023).
- Wang, W., et al. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142 (2021).
- Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. J Neuroinflammation. 19 (1), 83 (2022).
- Wang, Y. C., et al. Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis. Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).
- Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain. J Vis Exp. 108, e53658 (2016).
- Srakocic, S., et al. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods’ evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976 (2022).
- Disano, K. D., et al. Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells. J Vis Exp. 159, e61166 (2020).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
- Mcgill, C. J., Lu, R. J., Benayoun, B. A. Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (4), 100948 (2021).
- Su, Y., et al. Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights. J Neuroinflammation. 20 (1), 125 (2023).
- Niu, C., et al. Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis. STAR Protoc. 4 (2), 102272 (2023).
- Roussel-Queval, A., Rebejac, J., Eme-Scolan, E., Paroutaud, L. A., Rua, R. Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments. STAR Protoc. 4 (1), 102119 (2023).
- Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50 (2018).
