JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Реконструкция наземного палеоклимата и палеоэкологии по ископаемым листьям с использованием цифровой физиогномики листьев и массы листьев по площади

Published: October 25, 2024
doi:
10.3791/66838
, , , , ,
1Department of Biology,University of Washington, 2Department of Paleobiology, National Museum of Natural History,Smithsonian Institution, 3Department of Geology and Geophysics, Program in Ecology,University of Wyoming, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology,University of Michigan Herbarium, 5Department of Earth and Environmental Sciences,Wesleyan University, 6Department of Geosciences,Baylor University

Summary

Представленный протокол представляет собой цифровое измерение и анализ непрерывных физиогномических признаков листьев на ископаемых листьях для реконструкции палеоклимата и палеоэкологии с использованием цифровых методов реконструкции физиогномики листа и массы листа на площадь.

Abstract

Климат и окружающая среда сильно влияют на размер, форму и зубастость (физиономию) листьев растений. Эти отношения, особенно у древесных неоднодольных покрытосеменных, были использованы для разработки основанных на листьях прокси для палеоклимата и палеоэкологии, которые были применены для реконструкции древних наземных экосистем за последние ~120 миллионов лет истории Земли. Кроме того, учитывая, что эти взаимосвязи были задокументированы на живых растениях, они важны для понимания аспектов эволюции растений и того, как растения реагируют на климатические и экологические изменения. Для проведения такого рода анализов на современных и ископаемых растениях необходимо точно измерить физиономию листьев с использованием воспроизводимой методологии. Этот протокол описывает компьютерный метод измерения и анализа различных физиогномических переменных листьев в современных и ископаемых листьях. Этот метод позволяет измерить физиогномические признаки листьев, в частности переменные, связанные с зазубренностью листьев, площадью листа, рассечением листьев и линейностью, которые используются в цифровом прокси физиогномики листьев для реконструкции палеоклимата, а также ширину черешка и площадь листа, которые используются для реконструкции массы листа на площадь, палеоэкологический прокси. Поскольку этот цифровой метод измерения признаков листьев может быть применен к окаменелым и живым растениям, он не ограничивается приложениями, связанными с реконструкцией палеоклимата и палеоэкологии. Он также может быть использован для изучения признаков листьев, которые могут быть информативными для понимания функции морфологии листьев, развития листьев, филогенетических отношений признаков листьев и эволюции растений.

Introduction

Листья являются основными производственными единицами, которые способствуют обмену энергией (например, светом, теплом) и веществом (например, углекислым газом, водяным паром) между растением и окружающей средой 1,2. Для выполнения этих функций листья должны механически поддерживать собственный вес против силы тяжести в неподвижном и ветреном воздухе 3,4. Благодаря этим неразрывным связям, некоторые аспекты размера, формы и зубастости листьев (физиогномика) отражают детали их функции и биомеханики и дают представление об окружающей среде и экологии. В предыдущей работе была проведена количественная оценка взаимосвязи между физиогномикой листьев, климатом и экологией в современном мире, чтобы установить косвенные показатели, которые могут быть применены к комплексам ископаемых листьев 5,6. Эти прокси предоставляют важные возможности для реконструкции палеоклимата и палеоэкологии и способствуют лучшему пониманию сложного взаимодействия между различными системами планеты на протяжении всей ее истории. В данной статье подробно описаны методы, необходимые для использования двух прокси: 1) метод реконструкции массы листьев на площадь для выяснения палеоэкологии и 2) цифровая физиогномика листа для реконструкции палеоклимата.

Сухая масса листьев на площадь (МА) является часто измеряемым признаком растений как в нео-, так и в палеоботанике. Основная ценность MA, особенно для ископаемых реконструкций, заключается в том, что он является частью спектра экономики листьев, скоординированной оси хорошо коррелированных признаков листьев, которая включает в себя скорость фотосинтеза листьев, долговечность листьев и содержание питательных веществ в листьяхпо массе. Возможность реконструировать МА по окаменелостям открывает окно в эти иначе недоступные метаболические и химические процессы и, в конечном счете, может раскрыть полезную информацию об экологической стратегии растений и функционировании экосистемы.

Royer et al.5 разработали метод оценки MA древесных неоднодольных (двудольных) ископаемых листьев покрытосеменных растений на основе площади листовой пластинки и ширины черешка. Теоретически черешок листа выступает в роли консоли, удерживая вес листа в оптимальном положении 3,4. Поэтому площадь поперечного сечения черешка, составляющая наиболее значимую составляющую прочности луча, должна сильно коррелировать с массой листа. Упростив форму черешка до цилиндрической трубки, площадь поперечного сечения черешка может быть представлена квадратом ширины черешка, что позволяет оценить массу листа по двумерному ископаемому (подробнее см. Royer et al.5). Площадь листа может быть измерена напрямую. Вместе ширина черешка в квадрате делится на площадь листа (т.е. метрика черешка; Таблица 1) обеспечивает хороший показатель для ископаемого МА и позволяет палеоботаникам войти в современную экологию, основанную на признаках. Методы реконструкцииM A также были распространены на широколистные и черешковые голосеменные растения 5,8, травянистые покрытосеменные растения8 и папоротники9, которые показали отношения, отличающиеся от отношений, наблюдаемых для древесных двудольных покрытосеменных растений и друг от друга. Расширенный набор данных древесных двудольных растений и новые уравнения регрессии для реконструкции дисперсии и среднего значения MA на уровне участка позволяют сделать вывод о разнообразии экономических стратегий листьев и о том, какие стратегии наиболее распространены среди покрытосеменных древесных двудольных растений в ископаемых флорах10.

Взаимосвязь между физиогномическими особенностями листьев и их климатом отмечена уже более века 11,12. В частности, физиономия листьев древесных двудольных покрытосеменных растений сильно коррелирует с температурой и влажностью13. Эта взаимосвязь легла в основу многочисленных одномерных 14,15,16,17 и многомерных 6,18,19,20,21,22 листовых физиогномических прокси для земного палеоклимата. Как одномерные, так и многомерные методы физиогномической палеоклимата листьев широко применялись к ископаемым флорам с преобладанием покрытосеменных растений на всех континентах, охватывающих последние ~120 миллионов лет истории Земли (от мелового периода до современного)23.

Два фундаментальных наблюдения, используемых в физиогномических палеоклиматических показателях листьев, заключаются в следующем: 1) взаимосвязь между размером листьев и среднегодовым количеством осадков (MAP) и 2) взаимосвязь между зубьями листьев (т.е. проекциями края листа наружу) и среднегодовой температурой (MAT). В частности, средний размер листьев всех видов древесных двудольных покрытосеменных растений в данной местности положительно коррелирует с MAP, а доля древесных видов двудольных покрытосеменных растений в местности с зубчатыми листьями, в дополнение к размеру и количеству зубов отрицательно коррелирует с MAT 6,12,13,14,15,16,24.

Функциональная связь между этими взаимоотношениями между физиогномией листьев и климатом в значительной степени подтверждается как теорией, так и наблюдениями 1,2,25. Например, хотя более крупные листья обеспечивают большую площадь фотосинтетической поверхности, они требуют большей поддержки, теряют больше воды за счет транспирации и сохраняют более ощутимое тепло благодаря более толстому пограничному слою 1,26,27. Таким образом, более крупные листья более распространены во влажной и жаркой среде, потому что потеря воды из-за повышенной транспирации эффективно охлаждает листья и является менее проблематичной. Напротив, более мелкие листья в более сухом жарком климате уменьшают потерю воды и предотвращают перегрев, вместо этого увеличивая ощутимые потери тепла28,29. Детали того, какие факторы или комбинация факторов вносят наибольший вклад в объяснение функциональных связей, остаются загадкой для других признаков листа. Например, было предложено несколько гипотез для объяснения взаимосвязи между зубами листа и MAT, включая охлаждение листьев, эффективную упаковку почек, улучшенную поддержку и снабжение тонкими листьями, гуттирование через гидатоды иповышение продуктивности в начале сезона.

Большинство физиогномических палеоклиматических показателей листьев основаны на категориальном делении признаков листьев, а не на количественных измерениях непрерывных переменных, что приводит к ряду потенциальных недостатков. Категориальный подход исключает включение более подробной информации, полученной в результате непрерывных измерений, которые сильно коррелируют с климатом (например, количество зубов, линейность листьев), что может снизить точность палеоклиматических оценок 6,20,34. Кроме того, в некоторых методах оценки признаков листьев черты, которые категорически оцениваются, могут быть неоднозначными, что приводит к проблемам воспроизводимости, а некоторые признаки имеют ограниченные эмпирические данные, подтверждающие их функциональную связь с климатом 6,15,16,35,36.

Чтобы устранить эти недостатки, Huff et al.20 предложили цифровое измерение непрерывных признаков листьев с помощью метода, известного как цифровая физиогномика листа (DiLP). Ключевым преимуществом DiLP по сравнению с предыдущими методами является его зависимость от признаков, которые 1) могут быть надежно измерены у всех пользователей, 2) являются непрерывными по своей природе, 3) функционально связаны с климатом и 4) демонстрируют фенотипическую пластичность между вегетационными периодами 6,37. Это привело к более точным оценкам MAT и MAP по сравнению с предыдущими методами физиогномической палеоклимата листьев6. Кроме того, этот метод учитывает несовершенный характер летописи окаменелостей, предоставляя шаги для объяснения поврежденных и неполных листьев. Метод DiLP был успешно применен к целому ряду ископаемых флор с нескольких континентов, охватывающих большой диапазон геологического времени 6,38,39,40,41,42.

Следующий протокол является расширением протокола, описанного в более ранней работе 5,6,20,34. В нем будут объяснены процедуры, необходимые для реконструкции палеоклимата и палеоэкологии из ископаемых листьев древесных двудольных покрытосеменных растений с использованием методов реконструкции DiLP и MA (см. Таблицу 1 для объяснения переменных, измеренных и рассчитанных с использованием этого протокола). Кроме того, этот протокол предусматривает шаги по регистрации и расчету признаков листьев, не включенных в анализ DiLP или MA, но простых в реализации и обеспечивающих полезные характеристики физиогномики листьев (Таблица 1). Протокол имеет следующий формат: 1) Визуализация ископаемых листьев; 2) цифровая подготовка листа, организованная в пять возможных сценариев подготовки; 3) цифровое измерение листьев, организованное в те же пять возможных сценариев подготовки; и 4) анализы DiLP и MA с использованием пакета R dilp10.

Протокол для реконструкций MA встроен в протокол DiLP, потому что оба они удобны для подготовки и измерения рядом друг с другом. Если пользователя интересует только анализ MA , он должен следовать шагам подготовки, описанным в сценарии подготовки DiLP 2, независимо от того, является ли край листа зубчатым или нет, а также шагам измерения, описывающим только ширину черешка, площадь черешка и площадь листа. Затем пользователь может запустить соответствующие функции в пакете dilp R, который выполняет реконструкцию MA .

Protocol

1. Визуализация ископаемых листьев Поместите окаменелость листа под камеру и убедитесь, что она лежит как можно ровнее, используя, например, песочницу или замазку, чтобы вклиниться под окаменелость.ПРИМЕЧАНИЕ: При фотографировании нескольких образцов на одном блоке лучше всего фотографировать их крупным планом отдельно, чтобы детали окаменелости были четкими и четкими. Также полезно разместить окаменелость на однотонном темном матовом фоне, например, черном войлоке или бархате. Поместите масштабную линейку горизонтально и в той же вертикальной плоскости, что и лист, расположив ее близко к окаменелости, но не закрывая ее частей. Если матрицы вокруг окаменелости мало или совсем нет, масштаб должен быть помещен в фоторамку и находиться в фокусе. Используя штатив для камеры или подставку для копирования, расположите камеру прямо над листом окаменелостей так, чтобы объектив был параллельен поверхности породы. Чтобы обеспечить четкую передачу деталей листа, расположите камеру как можно ближе к окаменелости, оставаясь в пределах фокусного расстояния объектива/камеры и следя за тем, чтобы вся окаменелость находилась в кадре фотографии.ПРИМЕЧАНИЕ: Если это возможно, лучше всего использовать цифровую камеру с высоким разрешением и макрообъектив с ручной фокусировкой и достаточной глубиной резкости, чтобы четко сфокусироваться на листе, который будет обработан. Используя непрямой свет, освещайте окаменелость по мере необходимости, чтобы четко увидеть весь контур образца. Часто приходится перенастраивать освещение для каждого ископаемого. Сфотографируйте ископаемый лист и подпишите файл изображения соответствующим образом. 2. Цифровая подготовка ПРИМЕЧАНИЕ: Иллюстрация терминологии листовой архитектуры, используемой в этих протоколах, представлена на рисунке 1. Используйте дерево решений (рисунок 2) и приведенные примеры (рисунок 3), чтобы определить, какой сценарий подготовки применим к ископаемому листу, подлежащему измерению, и перейдите к соответствующему разделу. В таблице 2 приведены дополнительные соображения на этапах подготовки. Если лист попадает под сценарий 1 или 5, лист не может быть подготовлен к количественным измерениям физиономии листа. Сценарий 2: Весь лист с полями, площадь или половина которого сохранена или может быть реконструирована.Откройте файл в программе обработки изображений (например, Adobe Photoshop или GIMP). При необходимости обрежьте изображение, что поможет уменьшить окончательный размер файла, но гарантирует, что масштабная линейка все еще будет включена. Увеличьте ширину рабочей области в два раза, нажав на Изображение > Холст (Photoshop); Размер изображения > холста (GIMP). Рекомендуется добавить новый холст справа или слева от текущего холста. Если край листа требует некоторой реконструкции, решите, можно ли более надежно измерить площадь и форму листа по половине листа или по целому листу (Рисунок 3). Скопируйте лист из матрицы горных пород. Обведите весь лист или его половину, включая черешок, если он есть, с помощью лассо (см. Таблицу 2). Скопируйте и вставьте выделение и поместите его в открытую область холста. Подумайте о том, чтобы вставить две копии этого выделения, одна из которых будет неотредактированной, чтобы вернуться к ней в случае необходимости для перезапуска процесса подготовки. Восстановите все поврежденные участки поля, используя линию соответствующего цвета (обычно черную, если она на белом фоне). Нарисуйте линию, охватывающую поврежденное поле, чтобы поле было надежно восстановлено, например, с помощью кисти или инструмента для работы с линией. Убедитесь, что линия достаточно толстая, чтобы ее можно было увидеть (вес ~1-2 pt) и что она соединяет край через поврежденную область. Удалите черешок с листа, если он есть, с помощью инструмента с лассо.Визуально следите за краем листа вдоль основания до тех пор, пока он не соприкоснется с черешком, который часто темнее по цвету и не содержит характерных прожилок. Поместите туда точку лассо. Проделайте то же самое на другой половине листа и поместите туда вторую точку.ПРИМЕЧАНИЕ: Если основание листа симметрично, линия будет ~перпендикулярна черешку; Если она ассиметрична, линия будет находиться под углом. Обведите вокруг всего черешка, чтобы завершить выделение. Вырежьте и вставьте или используйте инструмент для перемещения, чтобы поместить черешок рядом с листовой пластинкой, но не касаясь ее.ПРИМЕЧАНИЕ: Для сердцевидного или лопастного основания листа, то есть основание простирается ниже того места, где черешок прикрепляется к листовой пластинке, черешок может опираться на основание листа ниже того места, где черешок прикрепляется к листовой пластинке. Позаботьтесь о том, чтобы вырезать черешок в том месте, где он фактически прикрепляется, тщательно проведите по краю черешка и восстановите поврежденный край. Признано, что это может быть трудно увидеть в большинстве окаменелостей. При необходимости обрежьте последнюю область изображения, чтобы уменьшить размер файла. На рисунке 3 приведен пример того, как должно выглядеть готовое изображение. Сценарий 3: зубчатый лист, площадь или половина которого не может быть восстановлена, но имеет ≥ два последовательных зубца и сохранилось ≥25% листаПРИМЕЧАНИЕ: Измерения зубов являются единственными признаками, которые можно измерить на листьях этой категории, поэтому листья подготавливаются только к этим измерениям.Откройте файл в программном обеспечении для обработки изображений (например, Adobe Photoshop или GIMP). При необходимости обрежьте изображение, что поможет уменьшить окончательный размер файла, но убедитесь, что масштабная линейка все еще включена. Трип, чтобы увеличить ширину рабочей области в четыре раза, нажав на Изображение > Холст (Photoshop); Размер изображения > холста (GIMP). Рекомендуется добавить новый холст справа или слева от текущего холста. Скопируйте лист из матрицы горных пород. Обведите протяженность сохранившегося листа, включая черешок, если он есть, с помощью инструмента с лассо. Не беспокойтесь о прослеживании поврежденных участков поля именно потому, что они будут удалены. Скопируйте и вставьте выделение и поместите его в открытую область холста. Рассмотрите возможность вставки двух копий этого выбора, одна из которых будет неотредактированной, чтобы вернуться к ней в случае необходимости для перезапуска процесса подготовки. Если он присутствует, удалите черешок с листа с помощью инструмента с использованием лассо.Визуально следите за краем листа вдоль основания до тех пор, пока он не соприкоснется с черешком, который часто темнее по цвету и не содержит характерных прожилок. Поместите туда точку лассо. Проделайте то же самое на другой половине листа и поместите туда вторую точку.ПРИМЕЧАНИЕ: Если основание листа симметрично, линия будет ~перпендикулярна черешку, если асимметрична, линия будет под углом. Обведите вокруг всего черешка, чтобы завершить выделение. Вырежьте и вставьте или используйте инструмент для перемещения, чтобы поместить черешок рядом с листовой пластинкой, но не касаясь ее.ПРИМЕЧАНИЕ: Для сердцевидного или лопастного основания листа, то есть основание простирается ниже того места, где черешок прикрепляется к листовой пластинке, черешок может опираться на основание листа ниже того места, где черешок прикрепляется к листовой пластинке. Позаботьтесь о том, чтобы вырезать черешок в том месте, где он фактически прикрепляется, тщательно проведите по краю черешка и восстановите поврежденный край. Это может быть трудно заметить в большинстве окаменелостей. Удалите область, прилегающую к поврежденным частям поля, с помощью инструмента для лассо.Начните выделение с точки вдоль края, ограничивающего поврежденную часть, и проведите прямую линию от этой точки до главной вены, перпендикулярной этой большой вене (рис. 4). Начинайте выделение с сохраненной пазухи молочного зуба, ближайшей к месту повреждения. Это гарантирует, что боковая сторона зуба не будет включена в качестве внутреннего периметра при последующих измерениях, а вспомогательные зубы не будут измеряться так, как если бы они были молочными. Это может быть нецелесообразно, если зубы расположены на большом расстоянии, так как слишком большой сохранившийся край может быть удален (Рисунок 4). Продолжайте выделение вдоль главной жилки до уровня другой границы поврежденного края и проведите прямую линию перпендикулярно главной жилке к краю (рис. 4).ПРИМЕЧАНИЕ: Для перистых листьев (Рисунок 1А), с агрофическими прожилками и без них (см. Ellis et al.43), главной жилкой является первичная жилка (т.е. средняя жилка). Для листьев с пальчатыми прожилками (рис. 1B,D) главная жилка является ближайшей первичной жилкой (например, рис. 4B). Для перисто-лопастных листьев (рис. 1C), если повреждение расположено на перистой доле, главной жилкой является жилка (обычно вторичная жилка), которая питает долю. Завершите выделение и удалите эту часть листа. Повторите для всех поврежденных участков листа. Скопируйте и вставьте этот подготовленный лист и поместите его на открытую область холста. Удалите зубчики с помощью лассо.Начните с верхушки листа, одной из вершин лопастей или самого апикального зуба фрагмента листа и сделайте выбор у каждой пазухи первичного зуба вдоль этого листа, доли или фрагмента (рис. 5; см. дополнительный рисунок 1, дополнительный рисунок 2 для советов о том, как различать молочные и вспомогательные зубы и как отличать зубы от долей). Обязательно соблюдайте соответствующие правила при вырезании зубов (Таблица 2; Дополнительный рисунок 3).ПРИМЕЧАНИЕ: Молочные зубы часто становятся меньше к основанию и верхушке. После выбора апикальной пазухи самого базального зуба примените правило удлинения (табл. 2; Дополнительный рисунок 4), чтобы вырезать последний зубец последовательности. Удалите зубья, вырезав и вставив зубья рядом с листовой пластинкой, при этом зубья будут удалены, не касаясь ее. Если препарат имеет дополнительные доли листа или фрагменты, требующие удаления зубов, повторяйте вышеуказанные действия до тех пор, пока не будут удалены все зубы. Если была создана дополнительная версия исходного листа выреза, удалите эту дополнительную версию. При необходимости обрежьте последнюю область изображения, чтобы уменьшить размер файла. На рисунке 3 приведен пример того, как должно выглядеть готовое изображение. Сценарий 4: зубчатый лист, площадь которого или площадь листа сохранена или может быть реконструированаОткройте файл в программе обработки изображений (например, Adobe Photoshop или GIMP). При необходимости обрежьте изображение, что поможет уменьшить окончательный размер файла, но убедитесь, что масштабная линейка все еще включена. Трип, чтобы увеличить ширину рабочей области в четыре раза, нажав на Изображение > Холст (Photoshop); Размер изображения > холста (GIMP). Рекомендуется добавить новый холст справа или слева от текущего холста. Определитесь, как будет подготовлен лист. Измерения площади/формы листа должны быть выполнены на целом листе или полулисте, решите, какой вариант приведет к более точным измерениям. Измерения зубов должны быть сделаны по всем участкам сохраненного края. В некоторых случаях измерения площади/формы листа могут проводиться на подмножестве листа, отличном от подмножества, в котором измеряются переменные зубьев.ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном примере (Рисунок 6) было решено, что половинка листа будет восстановлена более надежно, чем цельный лист. Сохранившийся край в правом нижнем углу (>1 сохранившийся зуб) был включен для измерения зубов. Следующий протокол для сценария 4 в общих чертах повторяет приведенный пример (рисунок 6), но детали могут незначительно отличаться в разных контекстах подготовки. Скопируйте лист из матрицы горных пород, убедившись, что в нем сохранены все поля.Обведите край листа, включая черешок, если он есть, с помощью инструмента с лассо. Не отслеживайте поврежденные участки поля, которые не будут включены в измерения площади/формы именно потому, что они будут удалены (например, правая половина листа на рисунке 6). Скопируйте и вставьте выделение, и поместите его в открытую область холста. Подумайте о том, чтобы вставить две копии этого выделения, одну из которых можно будет оставить неотредактированной, чтобы вернуться к ней в случае необходимости для перезапуска процесса подготовки. Если он присутствует, удалите черешок с листа с помощью инструмента с лассо.Визуально следите за краем листа вдоль основания до тех пор, пока он не соприкоснется с черешком, который часто темнее по цвету и не содержит характерных прожилок. Поместите туда точку лассо. Проделайте то же самое на другой половине листа и поместите туда вторую точку.ПРИМЕЧАНИЕ: Если основание листа симметрично, линия будет ~перпендикулярна черешку; Если она ассиметрична, линия будет находиться под углом. Обведите вокруг всего черешка, чтобы завершить выделение. Вырежьте и вставьте, или используйте инструмент перемещения, чтобы поместить черешок рядом с листом, но не касаясь его.ПРИМЕЧАНИЕ: Для сердцевидного или лопастного основания листа, то есть основание простирается ниже того места, где черешок прикрепляется к листовой пластинке, черешок может опираться на основание листа ниже того места, где черешок прикрепляется к листовой пластинке. Обязательно вырежьте черешок в месте его прикрепления, тщательно обведите край черешка и восстановите поврежденный край (дополнительный рисунок 5). Это может быть трудно заметить в большинстве окаменелостей. Скопируйте и вставьте изолированный лист с удаленным черешком, чтобы создать вторую копию для подготовки к измерению зубов, и поместите ее на открытую область холста. Подготовьте версию листа для измерения площади листа и его формы.Если вы готовите половинку листа, обрежьте лишний материал листьев с помощью инструмента лассо, чтобы остался только полный полулист. Если вы готовите полный лист, не удаляйте листовой материал. При необходимости восстановите все поврежденные участки вдоль поля, используя линию соответствующего цвета с помощью инструмента «Линия» или «Кисть» (обычно это черная линия для белого фона). Убедитесь, что линия достаточно толстая, чтобы ее можно было увидеть (вес ~1-2 pt) и что она соединяет край через поврежденную область. Подготовьте вариант листа для измерения зубов.Удалите область, прилегающую к поврежденным частям поля, с помощью инструмента для лассо.Начните выделение с точки вдоль края, ограничивающего поврежденную часть, и проведите прямую линию от этой точки до главной жилы, перпендикулярной этой большой вене (Рисунок 4). Начинайте выделение с сохраненной пазухи молочного зуба, ближайшей к месту повреждения. Это гарантирует, что боковая сторона зуба не будет включена в качестве внутреннего периметра при последующих измерениях, а вспомогательные зубы не будут измеряться так, как если бы они были молочными. Это может быть нецелесообразно, если зубы расположены на большом расстоянии, так как слишком большой сохранившийся край может быть удален (Рисунок 4). Продолжайте выделение вдоль главной жилки до уровня другой границы поврежденного края и проведите прямую линию, перпендикулярную большой жилке к краю (рисунок 4).ПРИМЕЧАНИЕ: Для перистых листьев (Рисунок 1A), с агрофическими прожилками и без них (см. определение и примеры в Ellis et al.43), главная жилка является первичной жилкой (т.е. средней жилкой). Для листьев с пальчатыми прожилками (рис. 1B,D) главная жилка является ближайшей первичной жилкой (например, рис. 4B). Для перисто-лопастных листьев (рис. 1C), если повреждение расположено на перистой доле, главной жилкой является жилка (обычно вторичная жилка), которая питает долю. Удалите поврежденную часть листа. Проделайте то же самое для всех поврежденных участков листа. Скопируйте и вставьте подготовленный для измерения зубов вариант, удалив поврежденные участки, и поместите на открытый участок холста. Удалите зубчики с помощью лассо.Начните с верхушки листа, одной из вершин лопастей или самого апикального зуба фрагмента листа и сделайте выбор у каждой пазухи первичного зуба вдоль листа, доли или фрагмента (рис. 5; см. дополнительный рисунок 2 для советов о том, как различать молочные и вспомогательные зубы и как отличать зубы от долей). Обязательно соблюдайте соответствующие правила при вырезании зубов (Таблица 2; Дополнительный рисунок 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Молочные зубы часто становятся меньше к основанию и верхушке. После выбора апикальной пазухи самого базального зуба примените правило удлинения (табл. 2; Дополнительный рисунок 4), чтобы вырезать последний зубец последовательности. Удалите зубья, вырезав и вставив зубья рядом с листовой пластинкой, при этом зубья будут удалены, не касаясь ее. Если препарат имеет дополнительные доли листа или фрагменты, требующие удаления зубов, повторяйте вышеуказанные действия до тех пор, пока не будут удалены все зубы. Если была создана дополнительная версия исходного вырезанного листа, удалите эту дополнительную версию. При необходимости обрежьте последнюю область изображения, чтобы уменьшить размер файла. На рисунке 3 приведен пример того, как должно выглядеть готовое изображение. 3. Цифровое измерение ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблон электронной таблицы для ввода данных предоставляется в виде дополнительного файла 1. В таблице 3 приведены дополнительные соображения по шагам измерения. В сценариях 1 и 5 единственным необходимым шагом является запись состояния поля листа в таблице ввода данных (шаг 3.5). Откройте программу ImageJ44. Укажите, какие измерения будут производиться автоматически (сделайте это один раз после установки программы). Нажмите кнопку Анализ > Задать измерения и выберите только Площадь, Периметр и диаметр Ферета. Убедитесь, что десятичные знаки равны 3. Откройте подготовленное изображение листа окаменелости, нажав «Файл» > «Открыть » или просто перетащив изображение на уже открытую панель инструментов ImageJ. Установите масштаб для каждого нового изображения листа.ПРИМЕЧАНИЕ: Это критически важный шаг, который необходимо выполнять для каждого нового изображения листа, чтобы обеспечить точные измерения.Нажмите на инструмент «Прямая линия». Увеличьте масштаб масштабной линейки и нарисуйте максимально длинную прямую линию на масштабной линейке. Нажмите «Анализ» > «Задать масштаб». В поле «Известное расстояние» введите длину, измеренную в см (чтобы она соответствовала единицам измерения, используемым в современном наборе данных калибровки). Менять единицу длины не нужно. Нажмите OK. Отметьте лист как зубчатый (0) или весь (1) в таблице ввода данных. Измерьте ширину черешка, если черешок присутствует. Измерения следует проводить на оригинальной копии листа, все еще находящейся в скальной матрице, так как это обеспечивает гораздо лучший контекст.ПРИМЕЧАНИЕ: Если черешок отсутствует, в некоторых случаях вместо черешка можно измерить ширину средней жилки в ее базальном положении. Однако это следует делать только в том случае, если сохранена вся ширина средней жилки (т.е. нет пластинки, сжатой поверх жилки, или окаменелость сохраняет абаксиальную сторону листа) и другие образцы того же вида или морфотипа показывают, что ширина базальной жилки эквивалентна ширине черешка.Проведите прямую линию перпендикулярно черешку, где черешок встречается с листовой пластинкой, или, если точка прикрепления ассиметрична, проведите линию, перпендикулярную черешку в самой базальной точке вставки. Важно провести эту линию аккуратно. Таким образом, рекомендуется увеличить масштаб этой области листа, чтобы было легче провести точную линию.ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют особые обстоятельства, при которых этот этап необходимо изменить, в том числе, если в самой базальной точке введения есть повреждения, трихомы, нектарники, шипы или другие особенности, которые препятствуют точному измерению ширины черешка. В этих случаях измерьте ширину черешка в первой точке под объектом, где можно надежно выполнить измерение. Нажмите кнопку Анализ > Измерить или используйте быструю команду для измерения длины нарисованной линии. Нарисуйте ту же линию на изображении, чтобы создать запись о том, где именно было произведено измерение, нажав «Правка» > «Нарисовать» или используя ярлык. При необходимости измените цвет линии с помощью инструмента на главной панели инструментов (палитры цветов). После того, как линия будет нарисована, сохраните изображение, желательно под измененным именем файла. Запишите длину этой линии в поле «Ширина черешка» в таблице ввода данных. Подготовьте лист к дополнительным измерениям, сделав изображение черно-белым. Для этого нажмите «Изображение» > Введите > 8 бит. Установите порог изображения, нажав «Изображение» > «Настроить порог> или используя ярлык». Откроется окно с именем Threshold и часть изображения изменится на красную. Если лист светлого цвета, а фон темный, нажмите «Темный фон». Регулируйте порог с помощью ползунка до тех пор, пока внутренняя часть листа не станет красной и не будет отличаться от фона. Это критически важный шаг и простое место для получения неточных данных. Убедитесь, что красная область точно соответствует листу (т.е. весь периметр листа красный и не более), увеличив некоторые участки поля. Красные промежутки внутри створки допустимы и не влияют на размеры.ПРИМЕЧАНИЕ: Если контур листа не определен четко, сначала попытайтесь настроить порог при увеличении, чтобы убедиться, что контур листа имеет красный цвет. Если плохой контраст между окаменелостью и фоном не позволяет установить надежный порог, используйте инструмент «Кисть», чтобы добавить сплошной контур по периметру листа в областях со слишком низким контрастом. В качестве альтернативы можно вернуть лист в программное обеспечение для обработки изображений (например, Adobe Photoshop или GIMP) и настроить контраст изолированных слоев листа или цвет фона, чтобы лучше различать их. Измерьте площадь и форму листьев, подготовленных в сценариях 2 (шаг 2.1) и 4 (шаг 2.4).ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте рисунки 2 и 6B в качестве ориентира для определения того, какие переменные измеряются на тех или иных компонентах подготовленного изображения. Если листья были подготовлены в сценарии 3 (шаг 2.2), пропустите этот шаг и перейдите к шагу 3.11.Измерьте лист, подготовленный для измерения площади и формы листа, для которого должен быть удален только черешок (если черешок присутствовал). Выберите инструмент « Палочка ». Нажмите на внутреннюю часть листа. Весь лист должен быть обведен желтым цветом — убедитесь, что контур правильный. Выполните измерения, нажав «Анализировать» > «Измерить » или с помощью ярлыка. Если измеряемая площадь подготавливается в виде целого листа, запишите площадь, периметр, Feret и минимальное Feret в таблице ввода данных. Если измеренная площадь подготовлена как полулист, запишите только Feret и переходите к следующему шагу. Если измеряемая площадь представляет собой половину листа, измерьте искусственный средний периметр листа, который представляет собой длину искусственного периметра, полученного в результате разрезания листа пополам (рисунок 6B). Если измеряемая площадь представляет собой весь лист, пропустите этот шаг и шаг 3.10.5.ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение искусственного среднего периметра позволяет рассчитать периметр лопасти по половинкам листьев (см. шаг 3.10.5 ниже). Периметр лопасти не используется в переменных, включенных в анализы DiLP и MA , но используется для других переменных, полезных для характеристики физиогномики (например, фактор формы, компактность; Таблица 1).Выберите инструмент сегментированной линии, щелкнув правой кнопкой мыши инструмент Линия . Обведите по всей длине искусственного среднего периметра. Нажмите «Анализировать» > «Измерить » или используйте быструю команду для измерения длины. Это измерение будет использоваться в формуле для расчета периметра лопасти ниже (шаг 3.10.5). Если измеряемая площадь представляет собой половину листа, измените измерения по мере их ввода в таблицу ввода данных, умножив площадь на 2, умножив минимальный Feret на 2 и рассчитав периметр лезвия, сначала вычтя искусственный средний периметр из периметра половины листа, а затем умножив на 2 по следующей формуле:Периметр лопасти = (периметр – искусственный средний периметр) x 2 Если присутствует вырез черешок, измерьте его площадь. Если его нет, измерение для сценария 2 завершено, но перейдите к шагу 3.11 для сценария 4.Кликните по вырезанному черешку с помощью палочки. Черешок должен быть обведен желтым цветом. Выполните измерения, нажав «Анализировать» > «Измерить » или с помощью ярлыка. Область записи под областью черешка в таблице ввода данных. Для сценария 2 (шаг 2.1) измерение завершено; Для сценария 4 (шаг 2.3) перейдите к следующему шагу. Измерьте переменные зубьев для листьев, подготовленных в сценариях 3 (шаг 2.2) и 4 (шаг 2.3).Измерьте необработанное лезвие. С помощью палочки выберите внутреннюю часть необработанного лезвия (т. е. лист, подготовленный для измерения зубов, на котором еще есть зубья; Рисунок 6B). Он должен быть обведен желтым цветом. Выполните измерения, нажав «Анализировать» > «Измерить » или воспользовавшись ярлыком.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от того, как лист был подготовлен, может потребоваться измерить несколько дизъюнктивных сечений, сложив их площади вместе (например, рисунок 6B). Кроме того, вы можете выбрать несколько секций одновременно, выбрав вторую секцию с помощью инструмента «Палочка», удерживая клавишу Shift . Запишите область и периметр под необработанной областью лезвия и периметром необработанного лезвия в таблице ввода данных. Измерьте внутреннее необработанное лезвие. Выберите внутреннюю часть внутреннего необработанного лезвия (т.е. лист, подготовленный для измерения зубьев, на котором зубья удалены; Рисунок 6B). Он должен быть обведен желтым цветом. Выполните измерения, нажав «Анализировать» > «Измерить » или с помощью ярлыка.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от того, как лист был подготовлен, может потребоваться измерить несколько дизъюнктивных сечений, сложив их площади вместе (например, рисунок 6B). Кроме того, вы можете выбрать несколько секций одновременно, выбрав вторую секцию с помощью инструмента «Палочка», удерживая клавишу Shift . Запишите область и периметр под внутренней областью необработанного лезвия и внутренним периметром необработанного лезвия в таблице ввода данных. Измерьте длину периметра реза. Удалите порог, чтобы четко увидеть лист, нажмите « Сброс » в поле порога или нажмите «Редактировать» > «Отменить» — последнее обычно также удаляет черно-белое 8-битное преобразование. Выберите инструмент «Сегментированная линия» и обведите по всей длине периметр реза на необработанном лезвии. Измерьте, нажав «Анализировать» > «Измерить » или с помощью ярлыка. Если участков несколько, повторите предыдущие шаги, чтобы измерить длину периметра разреза каждой части. Запишите длину или сумму длин в поле Длина периметра разреза в таблице ввода данных.ПРИМЕЧАНИЕ: Периметр среза вводится путем подготовки листа путем удаления повреждений. В большинстве случаев это отличается от искусственного среднего периметра (рисунок 6В). Подсчитайте молочные и вспомогательные зубы, если таковые имеются.ПРИМЕЧАНИЕ: На дополнительном рисунке 2 приведены советы о том, как различать молочные и вспомогательные зубы.Если порог еще не удален, удалите его сейчас. Чтобы удалить порог, нажмите « Сбросить » в поле порога или нажмите «Изменить» > «Отменить» — последнее обычно также удаляет черно-белое 8-битное преобразование. Подсчитайте количество молочных зубов (см. дополнительный рисунок 2 для советов о том, как различать молочные и вспомогательные зубы). Выберите инструмент «Многоточечный». Возможно, потребуется сначала щелкнуть правой кнопкой мыши по инструменту «Точка », чтобы выбрать инструмент «Многоточечный». Нажмите на каждый молочный зуб, чтобы пронумеровать его. Чтобы удалить ошибочно выбранную точку, нажмите клавишу Alt (Windows OS) или Command/cmd или option (Mac OS), одновременно щелкнув по точке. Запишите окончательное число молочных зубов под # в таблицу ввода данных. Очистите счетчики и аннотации многоточечных инструментов, нажав «Редактировать» > «Выделение» > «Выбрать нет », или используйте сочетание клавиш. Подсчитайте общее количество зубов (т.е. все молочные и вспомогательные зубы, присутствующие на листе). Выберите инструмент «Многоточечный». Возможно, потребуется сначала щелкнуть правой кнопкой мыши по инструменту «Точка », чтобы выбрать инструмент «Многоточечный». Нажмите на каждый зуб, включая основной и вспомогательный, чтобы пронумеровать его.ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет общего количества зубов, а не количества вспомогательных зубов, гарантирует, что зубы не будут учтены дважды. Общее количество зубов вычитается из числа молочных зубов для определения количества вспомогательных зубов (см. шаг 3.11.7.6). Чтобы удалить ошибочно выбранную точку, нажмите клавишу Alt (Windows OS) или Command/cmd или option (Mac OS), одновременно щелкнув по точке. Вычтите количество молочных зубов из общего числа зубов, чтобы определить количество вспомогательных зубов. Запишите это под # вспомогательных зубов в таблице ввода данных.ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые пользователи предпочитают подсчитывать количество зубьев при подготовке изображений листьев, а не при измерении. 4. Выполнение анализов в программном обеспечении R ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения следующих шагов требуется пакет R dilp11. Таблица ввода данных считывается в R и используется упаковкой. Обратитесь к вкладке «Дополнительные инструкции» в таблице ввода данных (Дополнительный файл 2). Скрипт R может выполнять анализ нескольких сайтов одновременно или одного сайта. Откройте R в предпочитаемой среде (рекомендуется использовать R Studio). Введение в R см., например, https://cran.r-project.org/doc/manuals/r-release/R-intro.pdf. Установите пакет dilp в сеанс R. Дополнительные сведения о том, как установить пакет и запустить связанные с ним функции, см. на следующем веб-сайте: https://cran.r-project.org/package=dilp Прочитано в файле .csv, содержащем данные о признаках листьев окаменелостей древесных двудольных покрытосеменных растений (т.е. данные, записанные в таблице ввода данных). Запустите функцию dilp() для реконструкции среднегодовой температуры (MAT) и среднегодового количества осадков (MAP) с соответствующей ошибкой. Результаты для MAT и MAP представлены на основе модели множественной линейной регрессии (MLR; т.е. DiLP) и двух моделей одиночной линейной регрессии (SLR; т.е. анализа площади листа и краев). Запустите функцию lma() для реконструкции массы листьев на площадь (MA) на уровне морфотипа и сайта. После запуска dilp() рекомендуется проверить наличие потенциальных проблем со сбором данных и подтвердить качество данных, посмотрев на выбросы и объекты ошибок в возвращенных результатах dilp(). В качестве альтернативы используйте функцию dilp_processing(), за которой следуют dilp_outliers() и dilp_errors(). Устраните все отмеченные проблемы, обратившись к подготовленному образцу и, возможно, повторно измерив его. Рекомендуется отредактировать исходный файл данных, а затем повторно прочитать его обратно в R. Определите, попадает ли участок окаменелости в физиогномическое многомерное пространство листа калибровочного набора данных с помощью функции dilp_cca().

Representative Results

Ранее опубликованный набор данных измерений физиогномики листьев из раннеэоценового участка окаменелостей Макаби в южной части центральной части Британской Колумбии был использован в качестве примера репрезентативных результатов с использованием методов реконструкции как цифровой физиогномики листа (DiLP), так и реконструкции: масса листа на площадь (MA) (Lowe et al.38; данные представлены в Дополнительном файле 2). Участок дает возможность реконструировать палеоклимат и палеоэкологию в самый теплый период кайнозоя (климатический оптимум раннего эоцена) в горном и вулканическом ландшафте 38,45,46,47. Ископаемые комплексы были отобраны из двух отдельных горизонтов в озерной последовательности, названной H1 (толщина 28 см) и H2 (толщина 27 см), объединенных в узком диапазоне стратиграфии с использованием метода переписи, в результате чего все образцы, которым можно было отнести морфотип, были собраны или подсчитаны38,48. Физиогномические данные листа Макаби прошли проверку на ошибки, отмеченные dilp_errors(), а семь выбросов, отмеченных dilp_outliers(), были перепроверены, чтобы убедиться, что значения представляют истинную вариацию данных, а не методологическую ошибку. Впоследствии данные были пропущены через функцию dilp() для создания палеоклимата и функцию lma() для реконструкции массы листьев на площадь. Реконструкции MA и нижняя и верхняя границы их 95% интервалов прогнозирования представлены в таблице 4 как на уровне вида, так и на уровне участка с использованием уравнений, представленных в Royer et al.5 и Butrim et al.10. Восстановленные значения находятся в пределахМА, характерного для современных наземных видов (30-330 г/м2)49. Используя пороговые значения, рассмотренные в работе Royer et al.5, большинство видов имеют реконструированный MA, который соответствует продолжительности жизни листьев <1 год (≤87 г/м2), некоторые ~ 1 год (88-128 г/м2), в то время как ни один из них не является типичным для >1 года (≥129 г/м2 года). Реконструкции среднего значения на участке МА и дисперсии на участке МакАби отражают распространенность и разнообразие экономических стратегий листьев на участке10,50. Нет заметных различий между средним значением по месту жительства и дисперсией между H1 и H2, и, таким образом, нет никаких доказательств того, что состав и разнообразие экономических стратегий листьев варьировались между двумя точками времени. Кроме того, реконструкции по сайту-среднему, сделанные с использованием уравнений Ройера и др.5 и Бутрима и др.10, были очень похожими. Реконструкция среднегодовой температуры (MAT) и среднегодового количества осадков (MAP) с использованием уравнений множественной линейной регрессии (DiLP) и одиночной линейной регрессии (анализ края листа и площади листа), представленных в Peppe et al.6 , представлена в таблице 5. Палеоклиматические оценки наиболее надежны в том случае, если физиономия листьев ископаемых сообществ листьев происходит в физиогномическом пространстве калибровочного набора данных. Это оценивается с помощью шага анализа канонического соответствия (CCA), выполняемого функцией dilp_cca(). Как McAbee H1, так и H2 попадают в диапазон физиогномики листьев, наблюдаемый в калибровочном наборе данных (рис. 7A). Если на участках были реконструированы значения, выходящие за пределы калибровочного пространства, палеоклиматические реконструкции следует интерпретировать с осторожностью (например, путем сравнения с независимыми линиями доказательств; см. Peppe et al.6 для дальнейшего обсуждения). Реконструированные MAT и MAP для H1 и H2 согласуются с умеренным сезонным биомом (рис. 7B, C), что хорошо согласуется с независимыми линиями доказательств, включая выводы о ближайших живых родственниках, основанные на выводах как ископаемых флористических, так и насекомых сообществ в McAbee45. Рисунок 1: Физиономия листа и архитектурная терминология в этой статье. (A) Лист с перисто-прожилками, без лопастей и с цельными краями, (B) лист с пальчатыми прожилками, без лопастей и зубцами, (C) лист с перисто-прожилками, лопастными и цельнокрайними краями, (D) лист с пальчатыми прожилками, лопастями и зубцами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 2: Блок-схема метода. Блок-схема, показывающая, как различные условия сохранности листьев и типы листьев определяют, какой общий тип признаков листьев можно надежно измерить (желтый прямоугольник). От этого зависит, какой сценарий подготовки будет использоваться в протоколе, и в каких столбцах данные будут заноситься в таблицу ввода данных (маркированные списки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 3: Различные сценарии подготовки. Различные сценарии подготовки, демонстрирующие примеры готовых цифровых изображений, готовых к этапу измерения. (А) Сценарий 1, цельный лист с полями, площадь или половина которого не может быть восстановлена, (В) Сценарий 5, зубчатый лист, площадь или половина которого не может быть реконструирована и не имеет ≥2 последовательных зубца и/или ≥25% сохраненного листа, (В) Сценарий 2, весь лист с полями, площадь или половина которого сохранена или может быть реконструирована, (D) Сценарий 3, зубчатый лист, площадь или половина которого не может быть восстановлена, но имеет ≥2 последовательных зубца и ≥25% листа, (E) Сценарий 4, зубчатый лист, площадь или половина которого сохранена или может быть реконструирована. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 4: Иллюстрация устранения повреждений. Иллюстрируем, как вырезать поврежденный край и область листа, прилегающую к этому поврежденному краю. Пунктирные красные линии показывают, как делаются выделения с помощью инструмента лассо. Обратите внимание, что границы повреждения были намеренно начаты в пазухах молочных зубов (см. дополнительный рисунок 2 для помощи в дифференциации молочных зубов от дочерних). (А) Лист с перисто-прожилочными прожилками, в котором выделение распространяется до середины жилки. (В) Лист с пальчатыми прожилками, где выбор распространяется до ближайшей первичной жилки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 5: Иллюстрация примера того, как вырезать зубы. (A) Пунктирные красные линии показывают, как выполняется выбор с помощью инструмента лассо. Обратите внимание, что в этом случае зубы сложные, поэтому выбор был сделан только между первичными пазухами (см. дополнительный рисунок 2 для помощи в дифференциации молочных и вспомогательных зубов), (В) увеличенная перспектива того, как был сделан выбор зубов, с красными точками, представляющими место щелчка мыши во время выбора, (В) копия листа при удалении зубов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 6: Иллюстрация сценария подготовки 4. Иллюстрация подготовительных решений и этапов измерения для примера листа, подготовленного в сценарии 4. (А) Сценарий препарирования, в котором было решено, что половина листа обеспечивает наиболее надежные измерения формы и площади листа, а сохраненные края на обеих медиальных половинах были включены для измерения зубов. (В) Пример, демонстрирующий, какие переменные измеряются на различных компонентах подготовленного листа. Жирным шрифтом выделены измерения, необходимые для анализа DiLP и MA , в то время как нежирным шрифтом выделены измерения (периметр лопастей, минимальный Feret и искусственный средний периметр) измерения, которые не являются обязательными, но полезны для дополнительных физиогномических характеристик (например, коэффициент формы и компактность; Таблица 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 7: Репрезентативные результаты. Результаты исследования двух горизонтов окаменелостей (H1 и H2), отобранных в ранних эоценовых пластах окаменелостей МакАби от Lowe et al.38. (A) Анализ канонического соответствия, показывающий представление многомерной физиономии листа в калибровочном наборе данных. Данные калибровки взяты из Peppe et al.6. Физиономия листьев двух горизонтов Макаби наложена друг на друга и залегает в калибровочном пространстве. (B и C) Оценки температуры и осадков, а также связанная с ними неопределенность (стандартные ошибки моделей) с использованием уравнений, представленных в Peppe et al.6 двух горизонтов Макаби, наложенных на диаграмму биома Уиттакера. (B) Оценки, реконструированные с использованием моделей множественной линейной регрессии (MLR) Digital Leaf Physiognomy (DiLP), (C) Оценки, реконструированные с использованием анализа площади листа (LAA) и анализа края листа (LMA) с помощью уравнений одиночной линейной регрессии (SLR) двух горизонтов Макаби, наложенных на диаграмму биома Уиттакера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Таблица 1: Физиогномические переменные листа. Переменные, которые измеряются и/или рассчитываются и применяются в прогностических моделях с использованием данного протокола для реконструкции сухой массы листьев на площадь (МА), среднегодовой температуры (MAT) и среднегодового количества осадков (MAP). MAT и MAP реконструируются с помощью уравнений, представленных в Peppe et al.6 с использованием многомерного подхода для цифровой физиогномики листа (DiLP) и одномерного подхода для анализа краев листа (LMA) и анализа площади листа (LAA). Переменные, перечисленные как «Другие», не используются в анализах MA, DiLP, LMA и LAA, но все же измеряются и рассчитываются с использованием этого протокола, поскольку они просты в реализации и обеспечивают полезную характеристику физиогномики листа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Таблица 2: Дополнительные соображения и пояснения по этапам подготовки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Таблица 3: Дополнительные соображения и пояснения по шагам измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Таблица 4: Реконструкции сухой массы листьев на площадь (MA) и связанных с ней верхних и нижних границ 95% интервалов прогнозирования для пластов окаменелостей МакАби по Lowe et al.38. Реконструкция проводится для среднего морфотипа5, среднего значения сайта 5,10 и дисперсиисайта 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Таблица 5: Реконструкции среднегодового умеренного (MAT) и среднегодового количества осадков (MAP) для горизонтов 1 (H1) и 2 (H2) в ранних эоценовых слоях окаменелостей Макаби с использованием множественных линейных регрессий (MLR) цифровой физиогномики листьев (DiLP) и одиночных линейных регрессий (SLR) анализа краевой поверхности листа (LMA) и анализа площади листьев (LAA), представленных в Peppe et al.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Дополнительный рисунок 1: Лист Quercus rubra из Гарвардского леса, иллюстрирующий правило доли и зуба. Отрезки линий p и d определяются в тексте. Масштабные линейки = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл. Дополнительный рисунок 2: Лист Betula lutea из Гарвардского леса, иллюстрирующий правила дифференциации вспомогательных зубов от молочных. Изолированный сегмент листа был увеличен в 2 раза. Синяя линия соединяет пазухи с наибольшей степенью разреза (т.е. первичные пазухи), а зубы, связанные с этими пазухами, считаются первичными (синие стрелки). Красными точками отмечены зубы, которые можно дифференцировать как вспомогательные, потому что их апикальные пазухи надрезаны в меньшей степени. Зубы, обозначенные красными стрелками, имеют аналогичную степень разреза по сравнению с молочными зубами, но могут быть идентифицированы как вспомогательные по относительно более тонкой калиброванной главной жилке по сравнению с молочными зубами. Масштабные линейки = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл. Дополнительный рисунок 3: Иллюстрация выбора зуба, правило перистой доли и правило приоритета доли. (А) Выбор зубьев для листа гамамелиса виргинского из заповедника Хайк. Затемненные участки соответствуют ткани листа, которая включается в общий отбор зубов, поскольку вспомогательные зубы дифференцируются от молочных. (B) Лист quercus alba из IES иллюстрирует правило приоритета лопастей. Затемненные участки измеряются как доли, а незатемненные — как зубы, но все проекции считаются долями в соответствии с правилом приоритета лепестков. Масштабные линейки = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл. Дополнительный рисунок 4: Лист Acer saccharum из Национального леса Аллегейни, иллюстрирующий правила расширения и одиночного зуба. Пунктирными линиями обозначены участки зубов. Сплошной линией обозначена ось симметрии для соответствующего зуба. Черная область — это груз, используемый для сплющивания листьев для фотосъемки. Масштабные линейки = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл. Дополнительный рисунок 5: Иллюстрация идеального способа вырезания черешка, расположенного поверх сердцевидного основания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 1: Шаблон ввода данных для всех измеряемых переменных цифровой физиогномики листа. Этот файл не следует изменять, так как он будет использоваться в качестве входного файла для пакета R. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 2: Примеры данных из ископаемых пластов МакАби от Lowe et al.38. Эти данные были использованы для получения рисунка 7 и для обсуждения репрезентативных результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 3: Документ с правилами для физиономии ископаемых цифровых листьев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

В этой статье рассказывается о том, как непрерывные черты физиогномики листьев могут быть измерены на ископаемых листьях древесных двудольных покрытосеменных растений и впоследствии применены к прокси, разработанным на основе современных калибровочных данных для реконструкции палеоклимата и палеоэкологии. Это требует принятия мер по согласованию методологических шагов с теми, которые представлены в наборах данных прокси-калибровки 5,6,10. Это рассмотрение начинается до применения данного протокола при сборе ископаемых листьев, особенно в отношении размера образца. Рекомендуется объединять сообщества ископаемых листьев в как можно более узком диапазоне стратиграфии для получения подходящего количества измеримых образцов и морфотипов, чтобы свести к минимуму усреднение по времени. Также рекомендуется ограничить палеоклиматическую реконструкцию участками, содержащими не менее 350 идентифицируемых образцов и не менее 15-20 морфотипов покрытосеменных древесных двудольных растений 19,51,52. Кроме того, при выборе листьев для анализа рекомендуется измерять как можно больше листьев на морфотип и, как минимум, выбирать образцы, которые представляют изменчивость физиогномики листа в пределах морфотипа.

При реализации секций подготовки и измерения необходимо проявлять дополнительную осторожность, чтобы они соответствовали калибровочному набору данных. Шаги, выполняемые на этапах подготовки, имеют наибольший потенциал субъективности и различные результаты у разных пользователей. Однако, если протокол соблюдается сознательно и часто ссылаются на таблицы дополнительных соображений (Таблица 2, Таблица 3) и документ с правилами (Дополнительный файл 3), этот метод приводит к объективным и воспроизводимым измерениям физиогномики листа. Для пользователей, плохо знакомых с этим методом, рекомендуется подтвердить, что листья были приготовлены правильно, с кем-то, у кого больше опыта. Особую осторожность следует проявлять при измерении ширины черешка для реконструкций МА . Поскольку эти значения имеют квадрат, погрешность в измерениях будет преувеличена. Неполная сохранность и повреждение могут изменить размеры черешка, поэтому их следует тщательно избегать.

У этих методов есть некоторые ограничения, на которые стоит обратить внимание. Наиболее важным является то, что прокси-реконструкции, включенные в пакет dilp R, относятся только к древесным двудольным покрытосеменным и, таким образом, могут исключать другие группы растений, которые были заметными компонентами древних сообществ. Тем не менее, были опубликованы дополнительные прокси на основе черешков листьев для MA на уровне видов для черешковых и широколистных голосеменных растений 5,8, травянистых покрытосеменных растений8 и папоротников9, которые пользователь может включить отдельно при желании. Исключение заметных групп растений в сообществах, выходящих за рамки древесных двудольных покрытосеменных растений, вероятно, окажет наибольшее влияние на реконструкцию среднего значения MA и дисперсии на уровне участка, поскольку они обеспечат неполную перспективу экономических стратегий в рамках всего сообщества. Филогенетическая история влияет на частоту появления листовыхзубов23, привнося возможность того, что анализ ископаемых сообществ с новым таксономическим составом может внести неопределенность в результирующие оценки, хотя реализация этого потенциального влияния еще не была проверена и продемонстрирована.

Ископаемые листья также должны быть адекватно сохранены, чтобы включить количественные измерения физиономии листа за пределами краевого состояния. Для DiLP это особенно верно для листьев со всеми полями, поскольку они могут вносить информацию за пределами состояния полей только в том случае, если весь лист или половина листа сохранены или могут быть восстановлены. Аналогичным образом, листья могут быть включены в реконструкцию МА только в том случае, если (1) сохранен их черешок при его вставке в листовую пластинку или, в особых случаях, если сохранено основание листа и самая прикорневая часть средней жилки (см. примечание к шагу 3.6), и (2) если можно оценить размер листа, либо путем измерения всего листа, либо путем реконструкции половины листа. Это означает, что некоторые морфотипы могут быть полностью исключены из анализа МА на уровне сайта. Наконец, время в этом протоколе ограничено, поскольку одномерные альтернативы палеоклиматическим реконструкциям требуют сравнительно меньше времени для создания.

Несмотря на эти ограничения, использование методов реконструкции DiLP и MA все же имеет ряд преимуществ перед другими методами. Реконструкция MA является одним из немногих способов реконструкции экономических стратегий листьев в летописи окаменелостей, а использование двумерных измерений ширины черешка и площади листа позволяет проводить реконструкции с использованием общих окаменелостей листьев отпечатка/сжатия. Для DiLP включение нескольких непрерывных измерений, которые функционально связаны с климатом, улучшает воспроизводимость измерений и точность результирующих реконструкций климата 6,13. Этот протокол разработан с учетом неполного характера палеонтологической летописи, позволяя проводить измерения зубастости листьев с использованием фрагментов листьев. Несмотря на то, что непрерывные измерения площади листьев дают больше информации о размере листьев, оценки DiLP MAP могут быть дополнены оценками размеров листьев с целью увеличения размера выборки16,53 или путем включения оценок масштаба прожилок площади листьев 42,54,55. Как и в случае с большинством задействованных методов, временная эффективность этого протокола будет повышаться по мере того, как пользователь становится более опытным и уверенным, особенно на этапах подготовки. Тот факт, что измерения DiLP на уровне участка были проведены в соответствии с этим протоколом для >150 современных 6,10,56 и, по крайней мере, 22 ископаемых комплексов, на сегодняшний день свидетельствует о его осуществимости: 6,38,39,40,41,42 . Наконец, всесторонние измерения физиогномики листьев имеют приложения, выходящие за рамки обсуждаемых здесь, и могут быть полезны при описании других аспектов экологии, физиологии, эволюции и развития растений, как в современныхисследованиях, так и в палеоисследованиях.

Таким образом, реализация методов, описанных в данной статье, позволяет пользователю реконструировать палеоклимат и палеоэкологию с использованием надежных и воспроизводимых методов. Эти методы предоставляют важную возможность продемонстрировать прошлые примеры реакции климата и экосистем на экологические возмущения, а также дать более глубокое понимание сложных взаимодействий природных систем Земли.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AJL благодарит студентов бакалавриата 2020-2022 годов Team Leaf в Университете Вашингтона за мотивацию и предложения по созданию эффективных учебных материалов для DiLP. AGF, AB, DJP и DLR благодарят многих студентов Уэслианского университета и Университета Бэйлора, которые измерили современные и ископаемые листья и чей вклад был неоценимым в изменение и обновление этого протокола. Авторы выражают признательность Рабочей группе PBot по количественным признакам и команде PBOT за поощрение работы по формализации этого протокола, чтобы сделать его более доступным для более широких сообществ. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (грант EAR-0742363 для DLR, грант EAR-132552 для DJP) и Университетом Бэйлора (Программа развития молодых исследователей для DJP). Мы благодарим двух анонимных рецензентов и редактора рецензентов за отзывы, которые помогли сделать этот протокол более ясным и полноценным.

Materials

Copy stand or tripod For fossil photography
Digital camera For fossil photography, high resolution camera preferred
Image editing software  For digital preperation. Examples include Adobe Photoshop and GIMP, the latter of which is free (https://www.gimp.org/)
ImageJ software IJ1.46pr For making digital measurments, free software (https://imagej.net/ij/index.html)
Microsoft Excel Microsoft Or similar software for data entry
R software The R foundation For running provided R script (https://www.r-project.org/). R studio offers a user friendly R enviornment (https://posit.co/download/rstudio-desktop/). Both are free.
dilp R Package Can be installed following instructions here: https://github.com/mjbutrim/dilp
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gates, D. M. Transpiration and leaf temperature. Ann Rev Plant Physiol. 19 (1), 211-238 (1968).
  2. Givnish, T. On the adaptive significance of leaf form. Topics Plant Pop Biol. , 375-407 (1979).
  3. Niklas, K. J. . Plant biomechanics: an engineering approach to plant form and function. , (1992).
  4. Niklas, K. J. . Plant Allometry: The Scaling of Form and Process. , (1994).
  5. Royer, D. L., et al. Fossil leaf economics quantified: Calibration, Eocene case study, and implications. Paleobiology. 33 (4), 574-589 (2007).
  6. Peppe, D. J., et al. Sensitivity of leaf size and shape to climate: global patterns and paleoclimatic applications. New Phytol. 190 (3), 724-739 (2011).
  7. Wright, I. J., et al. The worldwide leaf economics spectrum. Nature. 428 (6985), 821-827 (2004).
  8. Royer, D. L., Miller, I. M., Peppe, D. J., Hickey, L. J. Leaf economic traits from fossils support a weedy habit for early angiosperms. Am J Botany. 97 (3), 438-445 (2010).
  9. Peppe, D. J., et al. Biomechanical and leaf-climate relationships: a comparison of ferns and seed plants. Am J Botany. 101 (2), 338-347 (2014).
  10. . dilp: Reconstruct paleoclimate and paleoecology with leaf physiognomy. R package version 1.1.0 Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dilp/index.html (2024)
  11. Bailey, I. W., Sinnott, E. W. A botanical index of Cretaceous and Tertiary climates. Science. 41 (1066), 831-834 (1915).
  12. Bailey, I. W., Sinnott, E. W. The climatic distribution of certain types of angiosperm leaves. Am J Botany. 3 (1), 24-39 (1916).
  13. Peppe, D. J., Baumgartner, A., Flynn, A. G., Blonder, B. Reconstructing paleoclimate and paleoecology using fossil leaves. Meth Paleoecol: Reconstructing Cenozoic Terre Environ Ecol Comm. , 289-317 (2018).
  14. Wolfe, J. A. . Temperature parameters of humid to mesic forests of eastern Asia and relation to forests of other regions of the Northern Hemisphere and Australasia. , (1979).
  15. Wilf, P. When are leaves good thermometers? A new case for Leaf Margin Analysis. Paleobiology. 23 (3), 373-390 (1997).
  16. Wilf, P., Wing, S. L., Greenwood, D. R., Greenwood, C. L. Using fossil leaves as paleoprecipitation indicators: An Eocene example. Geology. 26 (3), 203-206 (1998).
  17. Miller, I. M., Brandon, M. T., Hickey, L. J. Using leaf margin analysis to estimate the mid-Cretaceous (Albian) paleolatitude of the Baja BC block. Earth Planetary Sci Lett. 245 (1), 95-114 (2006).
  18. Wing, S. L., Greenwood, D. R. Fossils and fossil climate: The case for equable continental interiors in the Eocene. Philosophical Transact: Biol Sci. 341 (1297), 243-252 (1993).
  19. Wolfe, J. A. A method of obtaining climatic parameters from leaf assemblages. U S Geol Sur. (2040), 1-71 (1993).
  20. Huff, P. M., Wilf, P., Azumah, E. J. Digital future for paleoclimate estimation from fossil leaves? Preliminary results. Palaios. 18 (3), 266-274 (2003).
  21. Spicer, R. A. Recent and future developments of CLAMP: Building on the legacy of Jack A. Wolfe. Adv Angiosperm Paleobotany Paleoclimatic Reconstruct. 258, 109-118 (2007).
  22. Yang, J., Spicer, R. A., Spicer, T. E. V., Li, C. S. CLAMP Online’: a new web-based palaeoclimate tool and its application to the terrestrial Paleogene and Neogene of North America. Palaeobiodivers Palaeoenviron. 91 (3), 163-183 (2011).
  23. Little, S. A., Kembel, S. W., Wilf, P. Paleotemperature proxies from leaf fossils reinterpreted in light of evolutionary history. PLoS One. 5 (12), e15161 (2010).
  24. Webb, L. J. A physiognomic classification of Australian rain forests. J Ecol. 47 (3), 551-570 (1959).
  25. Schmerler, S. B., et al. Evolution of leaf form correlates with tropical-temperate transitions in Viburnum (Adoxaceae). Proc Royal Soci B: Biol Sci. 279 (1744), 3905-3913 (2012).
  26. Nicotra, A. B., et al. The evolution and functional significance of leaf shape in the angiosperms. Funct Plant Biol. 38 (7), 535-552 (2011).
  27. Leigh, A., Sevanto, S., Close, J. D., Nicotra, A. B. The influence of leaf size and shape on leaf thermal dynamics: does theory hold up under natural conditions. Plant Cell Environ. 40 (2), 237-248 (2017).
  28. Wright, I. J., et al. Global climatic drivers of leaf size. Science. 357 (6354), 917-921 (2017).
  29. Givnish, T. J. Leaf and canopy adaptations in tropical forests. Physiol Ecol Plants Wet Tropics. 12, 51-84 (1984).
  30. Feild, T. S., Sage, T. L., Czerniak, C., Iles, W. J. Hydathodal leaf teeth of Chloranthus japonicus (Chloranthaceae) prevent guttation-induced flooding of the mesophyll. Plant, Cell Environ. 28 (9), 1179-1190 (2005).
  31. Royer, D. L., Wilf, P. Why do toothed leaves correlate with cold climates? Gas exchange at leaf margins provides new insights into a classic paleotemperature proxy. Int J Plant Sci. 167 (1), 11-18 (2006).
  32. Edwards, E. J., Spriggs, E. L., Chatelet, D. S., Donoghue, M. J. Unpacking a century-old mystery: Winter buds and the latitudinal gradient in leaf form. Botanical Soc Am. 103 (6), 975-978 (2016).
  33. Givnish, T. J., Kriebel, R. Causes of ecological gradients in leaf margin entirety: Evaluating the roles of biomechanics, hydraulics, vein geometry, and bud packing. Am J Botany. 104 (3), 354-366 (2017).
  34. Royer, D. L., Wilf, P., Janesko, D. A., Kowalski, E. A., Dilcher, D. L. Correlations of climate and plant ecology to leaf size and shape: potential proxies for the fossil record. Am J Botany. 92 (7), 1141-1151 (2005).
  35. Green, W. A. Loosening the CLAMP: an exploratory graphical approach to the climate leaf analysis multivariate program. Palaeontol Electro. 9 (2), 19 (2006).
  36. Peppe, D. J., Royer, D. L., Wilf, P., Kowalski, E. A. Quantification of large uncertainties in fossil leaf paleoaltimetry. Tectonics. 29 (3), 002549 (2010).
  37. Royer, D. L., Meyerson, L. A., Robertson, K. M., Adams, J. M. Phenotypic plasticity of leaf shape along a temperature gradient in Acer rubrum. PLoS One. 4 (10), e7653 (2009).
  38. Lowe, A. J., et al. Plant community ecology and climate on an upland volcanic landscape during the early Eocene climatic optimum: McAbee fossil beds, British Columbia, Canada. Palaeogeograp, Palaeoclimatol, Palaeoecol. 511, 433-448 (2018).
  39. Flynn, A. G., Peppe, D. J. Early Paleocene tropical forest from the Ojo Alamo Sandstone, San Juan Basin, New Mexico, USA. Paleobiology. 45 (4), 612-635 (2019).
  40. Allen, S. E., Lowe, A. J., Peppe, D. J., Meyer, H. W. Paleoclimate and paleoecology of the latest Eocene Florissant flora of central Colorado, U.S.A. Palaeogeograp, Palaeoclimatol, Palaeoecol. 551, 109678 (2020).
  41. Baumgartner, A., Peppe, D. J. Paleoenvironmental changes in the Hiwegi Formation (lower Miocene) of Rusinga Island, Lake Victoria, Kenya. Palaeogeograp, Palaeoclimatol, Palaeoecol. 574, 110458 (2021).
  42. Wagner, J. D., Peppe, D. J., O’keefe, J. M., Denison, C. N. Plant community change across the Paleocene-Eocene boundary in the Gulf coastal plain, Central Texas. Palaios. 38 (10), 436-451 (2023).
  43. Ellis, B., et al. . Manual of leaf architecture. , (2009).
  44. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Meth. 9, 671-675 (2012).
  45. Greenwood, D. R., Pigg, K. B., Basinger, J. F., DeVore, M. L. A review of paleobotanical studies of the Early Eocene Okanagan (Okanogan) Highlands floras of British Columbia, Canada, and Washington, USA. Canadian J Earth Sci. 53 (6), 548-564 (2016).
  46. Lowe, A. J., West, C. K., Greenwood, D. R. Volcaniclastic lithostratigraphy and paleoenvironment of the lower Eocene McAbee fossil beds, Kamloops Group, British Columbia, Canada. Canadian J Earth Sci. 55 (8), 923-934 (2018).
  47. Lowe, A. J., et al. Dynamics of deposition and fossil preservation at the early Eocene Okanagan Highlands of British Columbia, Canada: insights from organic geochemistry. Palaios. 37 (5), 185-200 (2022).
  48. Gushulak, C. A. C., West, C. K., Greenwood, D. R. Paleoclimate and precipitation seasonality of the Early Eocene McAbee megaflora, Kamloops Group, British Columbia. Canadian J Earth Sci. 53 (6), 591-604 (2016).
  49. Poorter, H., Niinemets, &. #. 2. 2. 0. ;., Poorter, L., Wright, I. J., Villar, R. Causes and consequences of variation in leaf mass per area (LMA): a meta-analysis. New Phytol. 182 (3), 565-588 (2009).
  50. Enquist, B. J., et al. Scaling from traits to ecosystems. Adv Ecol Res. 52, 249-318 (2015).
  51. Burnham, R. J., Wing, S. L., Parker, G. G. The reflection of deciduous forest communities in leaf litter: implications for autochthonous litter assemblages from the fossil record. Paleobiology. 18 (1), 30-49 (1992).
  52. Burnham, R. J., Ellis, B., Johnson, K. R. Modern tropical forest taphonomy: does high biodiversity affect paleoclimatic interpretations. PALAIOS. 20 (5), 439-451 (2005).
  53. Jacobs, B. F. Estimation of low-latitude paleoclimates using fossil angiosperm leaves: examples from the Miocene Tugen Hills, Kenya. Paleobiology. 28 (3), 399-421 (2002).
  54. Sack, L., et al. Developmentally based scaling of leaf venation architecture explains global ecological patterns. Nat Comm. 3 (1), 837 (2012).
  55. Merkhofer, L., et al. Resolving Australian analogs for an Eocene Patagonian paleorainforest using leaf size and floristics. Am J Botany. 102 (7), 1160-1173 (2015).
  56. Baumgartner, A., Donahoo, M., Chitwood, D. H., Peppe, D. J. The influences of environmental change and development on leaf shape in Vitis. Am J Botany. 107 (4), 676-688 (2020).

Tags

Environmental Sciences

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lowe, A. J., Flynn, A. G., Butrim, M. J., Baumgartner, A., Royer, D. L., Peppe, D. J. Reconstructing Terrestrial Paleoclimate and Paleoecology with Fossil Leaves Using Digital Leaf Physiognomy and Leaf Mass Per Area. J. Vis. Exp. (212), e66838, doi:10.3791/66838 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image