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Environment

Ricostruire il paleoclima terrestre e la paleoecologia con foglie fossili utilizzando la fisiognomica fogliare digitale e la massa fogliare per area

Published: October 25, 2024
doi:
10.3791/66838
, , , , ,
1Department of Biology,University of Washington, 2Department of Paleobiology, National Museum of Natural History,Smithsonian Institution, 3Department of Geology and Geophysics, Program in Ecology,University of Wyoming, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology,University of Michigan Herbarium, 5Department of Earth and Environmental Sciences,Wesleyan University, 6Department of Geosciences,Baylor University

Summary

Il protocollo presentato mostra la misurazione e l’analisi digitale dei tratti fisionomici fogliari continui su foglie fossili per ricostruire il paleoclima e la paleoecologia utilizzando i metodi di ricostruzione digitale della fisionomia fogliare e della massa fogliare per area.

Abstract

Il clima e l’ambiente influenzano fortemente le dimensioni, la forma e la dentatura (fisionomia) delle foglie delle piante. Queste relazioni, in particolare nelle angiosperme legnose non monocotiledoni, sono state utilizzate per sviluppare proxy basati sulle foglie per il paleoclima e la paleoecologia che sono stati applicati per ricostruire antichi ecosistemi terrestri per gli ultimi ~120 milioni di anni della storia della Terra. Inoltre, dato che queste relazioni sono state documentate nelle piante viventi, sono importanti per comprendere gli aspetti dell’evoluzione delle piante e il modo in cui le piante rispondono ai cambiamenti climatici e ambientali. Per condurre questo tipo di analisi su piante moderne e fossili, la fisionomia fogliare deve essere misurata accuratamente utilizzando una metodologia riproducibile. Questo protocollo descrive un metodo computerizzato per misurare e analizzare una varietà di variabili fisionomiche fogliari nelle foglie moderne e fossili. Questo metodo consente di misurare i tratti fisionomici delle foglie, in particolare le variabili relative alle dentellature fogliari, all’area fogliare, alla dissezione fogliare e alla linearità che vengono utilizzate nel proxy digitale della fisionomia fogliare per la ricostruzione del paleoclima, nonché la larghezza del picciolo e l’area fogliare, che vengono utilizzate per ricostruire la massa fogliare per area, un proxy paleoecologico. Poiché questo metodo digitale di misurazione dei tratti fogliari può essere applicato a piante fossili e viventi, non si limita alle applicazioni relative alla ricostruzione del paleoclima e della paleoecologia. Può anche essere utilizzato per esplorare i tratti fogliari che possono essere informativi per comprendere la funzione della morfologia fogliare, lo sviluppo delle foglie, le relazioni filogenetiche dei tratti fogliari e l’evoluzione delle piante.

Introduction

Le foglie sono unità di produzione fondamentali che facilitano lo scambio di energia (ad esempio, luce, calore) e materia (ad esempio, anidride carbonica, vapore acqueo) tra la pianta e l’ambiente circostante 1,2. Per svolgere queste funzioni, le foglie devono sostenere meccanicamente il proprio peso contro la gravità in aria ferma e ventosa 3,4. A causa di questi legami intrinseci, diversi aspetti delle dimensioni, della forma e della dentatura delle foglie (fisiognomica) riflettono i dettagli della loro funzione e biomeccanica e forniscono informazioni sul loro ambiente e sull’ecologia. Lavori precedenti hanno quantificato le relazioni tra fisionomia fogliare, clima ed ecologia in tutto il mondo moderno per stabilire proxy che possono essere applicati alle associazioni di foglie fossili 5,6. Questi proxy forniscono importanti opportunità per ricostruire il paleoclima e la paleoecologia e contribuiscono a una maggiore comprensione della complessa interazione tra i vari sistemi del pianeta nel corso della sua storia. Questo articolo descrive in dettaglio i metodi necessari per l’uso di due proxy: 1) il metodo di ricostruzione della massa fogliare per area per chiarire la paleoecologia e 2) la fisionomia digitale delle foglie per ricostruire il paleoclima.

La massa secca fogliare per area (MA) è un tratto vegetale frequentemente misurato sia in neobotanica che in paleobotanica. Il valore primario di MA, specialmente per le ricostruzioni fossili, è che fa parte dello spettro economico delle foglie, un asse coordinato di tratti fogliari ben correlati che include il tasso di fotosintesi fogliare, la longevità fogliare e il contenuto di nutrienti fogliari in massa7. La capacità di ricostruire l’MA dai fossili fornisce una finestra su questi processi metabolici e chimici altrimenti inaccessibili e, in ultima analisi, può rivelare informazioni utili sulla strategia ecologica delle piante e sulla funzione dell’ecosistema.

Royer et al.5 hanno sviluppato un metodo per stimare la MA delle foglie fossili di angiosperme legnose non monocotiledoni (dicotiledoni) in base all’area della lamina fogliare e alla larghezza del picciolo. In teoria, il picciolo fogliare funge da sbalzo, mantenendo il peso della foglia nella posizione ottimale 3,4. L’area della sezione trasversale del picciolo, che costituisce la componente più significativa della forza del fascio, dovrebbe, quindi, essere fortemente correlata con la massa della foglia. Semplificando la forma del picciolo in un tubo cilindrico, l’area della sezione trasversale del picciolo può essere rappresentata con la larghezza del picciolo al quadrato, consentendo di stimare la massa fogliare da un fossile bidimensionale (per maggiori dettagli, vedi Royer et al.5). L’area fogliare può essere misurata direttamente. Insieme, la larghezza del picciolo al quadrato divisa per l’area fogliare (cioè il picciolo metrico; Tabella 1) fornisce un buon proxy perl’M A fossile e consente ai paleobotanici di entrare nella moderna ecologia basata sui tratti. I metodi di ricostruzione MA sono stati estesi anche alle gimnosperme a foglia larga e picciolate 5,8, alle angiosperme erbacee8 e alle felci9, che hanno prodotto relazioni che differiscono dalle relazioni osservate per le angiosperme dicotiledoni legnose e tra loro. Un set di dati ampliato sulle dicotiledoni legnose e nuove equazioni di regressione per ricostruire la varianza e la media di MA a livello di sito consentono di dedurre la diversità delle strategie economiche fogliari e quali strategie sono più prevalenti, tra le angiosperme di dicotiledoni legnose nelle flore fossili10.

La relazione tra i caratteri fisionomici delle foglie e il loro clima è stata notata per oltre un secolo11,12. In particolare, la fisionomia delle foglie legnose di angiosperme dicotiledoni è fortemente correlata con la temperatura e l’umidità13. Questa relazione ha costituito la base per numerosi proxy fisionomici fogliari univariati 14,15,16,17 e multivariati 6,18,19,20,21,22 per il paleoclima terrestre. Sia i metodi paleoclimatici fisionomici univariati che quelli multivariati delle foglie sono stati ampiamente applicati alle flore fossili dominate dalle angiosperme in tutti i continenti che coprono gli ultimi ~120 milioni di anni di storia della Terra (dal Cretaceo all’età moderna)23.

Due osservazioni fondamentali utilizzate nei proxy paleoclimatici fisionomici fogliari sono 1) la relazione tra le dimensioni delle foglie e le precipitazioni medie annuali (MAP) e 2) la relazione tra i denti fogliari (cioè le proiezioni verso l’esterno del margine fogliare) e la temperatura media annuale (MAT). In particolare, la dimensione media delle foglie di tutte le specie di angiosperme dicotiledoni legnose in una località è correlata positivamente con la MAP, e la proporzione di specie di angiosperme dicotiledoni legnose in una località con foglie dentate, oltre alla dimensione e al numero di denti, correla negativamente con MAT 6,12,13,14,15,16,24.

Un legame funzionale tra queste relazioni fisionomiche-clima fogliare è fortemente supportato sia dalla teoria che dall’osservazione 1,2,25. Ad esempio, sebbene le foglie più grandi forniscano una maggiore superficie fotosintetica, richiedono un supporto maggiore, perdono più acqua attraverso la traspirazione e trattengono più calore sensibile a causa di uno strato limite più spesso 1,26,27. Pertanto, le foglie più grandi sono più comuni in ambienti più umidi e caldi perché la perdita d’acqua attraverso l’aumento della traspirazione raffredda efficacemente le foglie ed è meno problematica. Al contrario, le foglie più piccole nei climi caldi più secchi riducono la perdita d’acqua ed evitano invece il surriscaldamento aumentando la perdita di calore sensibile28,29. I dettagli su quali fattori, o combinazioni di fattori, contribuiscono maggiormente a spiegare i collegamenti funzionali rimangono enigmatici per altri tratti fogliari. Ad esempio, sono state proposte diverse ipotesi per spiegare la relazione tra denti fogliari e MAT, tra cui il raffreddamento delle foglie, l’impacchettamento efficiente delle gemme, il supporto e l’apporto migliorati di foglie sottili, la guttazione attraverso gli idatodi e l’aumento della produttività di inizio stagione 30,31,32,33.

La maggior parte dei proxy paleoclimatici fisionomici fogliari si basa sulla divisione categoriale dei tratti fogliari piuttosto che su misurazioni quantitative di variabili continue, portando a diverse potenziali carenze. L’approccio categoriale esclude l’incorporazione di informazioni più dettagliate catturate da misurazioni continue che sono fortemente correlate con il clima (ad esempio, numero di denti, linearità fogliare), che possono ridurre l’accuratezza delle stime paleoclimatiche 6,20,34. Inoltre, in alcuni dei metodi di punteggio dei tratti fogliari, i tratti che vengono valutati categoricamente possono essere ambigui, portando a problemi di riproducibilità, e alcuni tratti hanno prove empiriche limitate a sostegno del loro legame funzionale con il clima 6,15,16,35,36.

Per affrontare queste carenze, Huff et al.20 hanno proposto di misurare digitalmente i tratti fogliari continui in un metodo noto come fisiognomica fogliare digitale (DiLP). Un vantaggio chiave di DiLP rispetto ai metodi precedenti è la sua dipendenza da tratti che 1) possono essere misurati in modo affidabile tra gli utenti, 2) sono di natura continua, 3) sono funzionalmente legati al clima e 4) mostrano plasticità fenotipica tra le stagioni di crescita 6,37. Ciò ha portato a stime più accurate di MAT e MAP rispetto ai precedenti metodi paleoclimatici fisionomici fogliari6. Inoltre, il metodo tiene conto della natura imperfetta della documentazione fossile, fornendo passaggi per tenere conto delle foglie danneggiate e incomplete. Il metodo DiLP è stato applicato con successo a una gamma di flora fossile proveniente da più continenti che abbracciano un ampio intervallo di tempo geologico 6,38,39,40,41,42.

Il seguente protocollo è un’espansione di quello descritto nel precedente lavoro 5,6,20,34. Verranno illustrate le procedure necessarie per ricostruire il paleoclima e la paleoecologia da foglie fossili legnose di dicotiledoni, angiosperme utilizzando i metodi di ricostruzione DiLP e MA (vedi Tabella 1 per una spiegazione delle variabili misurate e calcolate attraverso l’uso di questo protocollo). Inoltre, questo protocollo fornisce passaggi per registrare e calcolare i caratteri fogliari non inclusi nell’analisi DiLP o MA ma che sono facili da implementare e forniscono utili caratterizzazioni della fisionomia fogliare (Tabella 1). Il protocollo segue il seguente formato: 1) Imaging di foglie fossili; 2) preparazione digitale fogliare, organizzata in cinque possibili scenari di preparazione; 3) misura digitale fogliare, organizzata negli stessi cinque possibili scenari di preparazione; e 4) analisi DiLP e MA, utilizzando il pacchetto R dilp10.

Il protocollo per le ricostruzioni MA è incorporato nel protocollo DiLP perché entrambi sono comodi da preparare e misurare l’uno accanto all’altro. Se un utente è interessato solo alle analisiM-A , deve seguire le fasi di preparazione descritte nello scenario di preparazione DiLP 2, indipendentemente dal fatto che il margine fogliare sia dentato o meno, e le fasi di misurazione che descrivono solo le misurazioni della larghezza del picciolo, dell’area del picciolo e dell’area fogliare. Un utente può quindi eseguire le funzioni appropriate nel pacchetto dilp R che esegue le ricostruzioni MA .

Protocol

1. Imaging di foglie fossili Posiziona la foglia fossile sotto la fotocamera e assicurati che sia il più piatta possibile usando, ad esempio, una sabbiera o uno stucco per incastrarlo sotto il fossile.NOTA: Quando si fotografano più esemplari su un singolo blocco, è meglio fotografarli separatamente in primo piano per garantire che i dettagli del fossile siano chiari e nitidi. È anche utile posizionare il fossile su uno sfondo opaco scuro solido, come il feltro nero o il velluto. Posiziona una barra di scala orizzontalmente e sullo stesso piano verticale della foglia, posizionandola vicino al fossile ma senza coprirne alcuna parte. Se c’è poca o nessuna matrice che circonda il fossile, la scala deve essere posizionata all’interno della cornice della foto ed essere a fuoco. Utilizzando un treppiede per fotocamera o un supporto per fotocopie, posizionare la fotocamera direttamente sopra la foglia fossile con l’obiettivo parallelo alla superficie rocciosa. Per garantire che i dettagli della foglia vengano catturati in modo nitido, posiziona la fotocamera il più vicino possibile al fossile, rimanendo entro la distanza focale dell’obiettivo/fotocamera e assicurandoti che l’intero fossile si trovi all’interno dell’inquadratura della fotografia.NOTA: Se possibile, è meglio utilizzare una fotocamera digitale ad alta risoluzione e un obiettivo macro con messa a fuoco manuale e profondità di campo sufficiente per mettere a fuoco nitidamente la foglia che verrà elaborata. Utilizzando la luce indiretta, illuminare il fossile secondo necessità per vedere chiaramente l’intero contorno dell’esemplare. Spesso è necessario regolare nuovamente l’illuminazione per ogni fossile. Fotografa la foglia fossile ed etichetta il file immagine in modo appropriato. 2. Preparazione digitale NOTA: Nella Figura 1 viene fornita un’illustrazione della terminologia dell’architettura foglia utilizzata in questi protocolli. Utilizzare l’albero decisionale (Figura 2) e gli esempi forniti (Figura 3) per determinare quale scenario di preparazione è applicabile alla foglia fossile da misurare e procedere alla sezione appropriata. Fare riferimento alla Tabella 2 per ulteriori considerazioni nelle fasi di preparazione. Se la foglia rientra nello scenario 1 o 5, la foglia non può essere preparata per le misurazioni quantitative della fisionomia fogliare. Scenario 2: foglia intera con margini la cui area, o metà area, viene conservata o può essere ricostruita.Aprire il file nel software di elaborazione delle immagini (ad esempio, Adobe Photoshop o GIMP). Ritaglia l’immagine, se necessario, il che aiuta a ridurre le dimensioni finali del file ma assicura che la barra di scala sia ancora inclusa. Raddoppia la larghezza dell’area di lavoro facendo clic su Immagine > tela (Photoshop); Immagine > dimensioni della tela (GIMP). Si consiglia di aggiungere una nuova area di disegno a destra o a sinistra dell’area di disegno corrente. Se il margine della foglia richiede una ricostruzione, decidere se l’area e la forma della foglia possono essere misurate in modo più affidabile da una mezza foglia o da un’intera foglia (Figura 3). Copia la foglia dalla matrice rocciosa. Tracciare l’intera foglia o la mezza foglia, compreso il picciolo se presente, utilizzando uno strumento lazo (vedi Tabella 2). Copia e incolla la selezione e posizionala in un’area aperta dell’area di disegno. Prendi in considerazione l’idea di incollare due copie di questa selezione, una delle quali è una non modificata a cui tornare se necessario per riavviare il processo di preparazione. Ripara eventuali parti danneggiate del margine utilizzando una linea di colore appropriato (tipicamente nera se su sfondo bianco). Disegnate una linea che si estenda lungo il margine danneggiato in modo che il margine venga ricostruito in modo affidabile, utilizzando, ad esempio, lo strumento pennello o linea. Assicurati che la linea sia abbastanza spessa da essere vista (~1-2 pt di peso) e che colleghi il margine attraverso l’area danneggiata. Rimuovere il picciolo dalla foglia, se presente, utilizzando lo strumento lazo.Visivamente, segui il margine della foglia lungo la base fino al punto in cui entra in contatto con il picciolo, che è spesso di colore più scuro e non contiene venature distintive. Posiziona lì un punto lazo. Fai lo stesso sull’altra metà della foglia e posiziona lì il secondo punto.NOTA: Se la base della foglia è simmetrica, la linea sarà ~perpendicolare al picciolo; Se è asimmetrica, la linea sarà ad angolo. Circondi l’intero picciolo per terminare la selezione. Taglia e incolla, o usa lo strumento di spostamento, per posizionare il picciolo vicino alla lama della foglia, ma senza toccarla.NOTA: Per una base fogliare cordata o lobata, il che significa che la base si estende al di sotto del punto in cui il picciolo si attacca alla lamina fogliare, il picciolo ha il potenziale per poggiare sulla base della foglia al di sotto del punto in cui il picciolo si attacca alla lamina fogliare. Fai attenzione a tagliare il picciolo dove si attacca effettivamente, traccia da vicino il margine del picciolo e ripara il margine danneggiato risultante. È noto che questo può essere difficile da vedere nella maggior parte dei fossili. Se necessario, ritaglia l’area finale dell’immagine per ridurre le dimensioni del file. Vedere la Figura 3 per un esempio di come dovrebbe apparire l’immagine preparata completata. Scenario 3: una foglia dentata la cui area, o metà area, non può essere ricostruita ma ha ≥ due denti consecutivi e ≥25% della foglia conservataNOTA: Le misure dei denti sono gli unici tratti che possono essere misurati sulle foglie di questa categoria, quindi le foglie vengono preparate solo per queste misurazioni.Apri il file in un software di elaborazione delle immagini (ad esempio, Adobe Photoshop o GIMP). Ritaglia l’immagine, se necessario, il che aiuta a ridurre le dimensioni finali del file, ma assicurati che la barra della scala sia ancora inclusa. Trippa per quadruplicare la larghezza dell’area di lavoro facendo clic su Immagine > Tela (Photoshop); Immagine > dimensioni della tela (GIMP). Si consiglia di aggiungere una nuova area di disegno a destra o a sinistra dell’area di disegno corrente. Copia la foglia dalla matrice rocciosa. Traccia l’estensione della foglia stabilizzata, compreso il picciolo se presente, utilizzando uno strumento lazo. Non preoccuparti di tracciare le parti danneggiate del margine proprio perché verranno rimosse. Copia e incolla la selezione e posizionala in un’area aperta dell’area di disegno. Prendi in considerazione la possibilità di incollare due copie di questa selezione, una delle quali è una versione non modificata a cui tornare se necessario per riavviare il processo di preparazione. Se presente, rimuovere il picciolo dalla foglia utilizzando lo strumento lazo.Visivamente, segui il margine della foglia lungo la base fino al punto in cui entra in contatto con il picciolo, che è spesso di colore più scuro e non contiene venature distintive. Posiziona lì un punto lazo. Fai lo stesso sull’altra metà della foglia e posiziona lì il secondo punto.NOTA: Se la base della foglia è simmetrica, la linea sarà ~perpendicolare al picciolo, se è asimmetrica, la linea sarà ad angolo. Circondi l’intero picciolo per terminare la selezione. Taglia e incolla, o usa lo strumento di spostamento, per posizionare il picciolo vicino alla lama della foglia, ma senza toccarla.NOTA: Per una base fogliare cordata o lobata, il che significa che la base si estende al di sotto del punto in cui il picciolo si attacca alla lamina fogliare, il picciolo ha il potenziale per poggiare sulla base della foglia al di sotto del punto in cui il picciolo si attacca alla lamina fogliare. Fai attenzione a tagliare il picciolo dove si attacca effettivamente, traccia da vicino il margine del picciolo e ripara il margine danneggiato risultante. Questo può essere difficile da vedere nella maggior parte dei fossili. Rimuovi l’area adiacente alle parti danneggiate del margine utilizzando uno strumento lazo.Iniziare la selezione in un punto lungo il margine che delimita la parte danneggiata e tracciare una linea retta da quel punto alla vena principale che è perpendicolare a quella vena principale (Figura 4). Iniziare la selezione dal seno del dente primario conservato più vicino al danno. Ciò garantisce che il fianco di un dente non sia incluso come perimetro interno nelle misurazioni successive e che i denti sussidiari non vengano misurati come se fossero denti primari. Questo potrebbe non essere appropriato se i denti sono distanziati alla distanza, poiché un margine troppo conservato potrebbe finire per essere rimosso (Figura 4). Procedere con la selezione lungo la vena maggiore fino a raggiungere il livello con l’altro limite del margine danneggiato e tracciare una linea retta perpendicolare alla vena maggiore fino al margine (Figura 4).NOTA: Per le foglie pennate (Figura 1A), con e senza nervature agrofiche (vedi Ellis et al.43), la vena principale è la vena primaria (cioè la vena mediana). Per le foglie palmate (Figura 1B, D), la vena principale è la vena primaria più vicina (ad esempio, Figura 4B). Per le foglie lobate pennate (Figura 1C), se il danno è localizzato su un lobo pennato, la vena principale è la vena (tipicamente una vena secondaria) che alimenta il lobo. Completate la selezione ed eliminate questa parte della foglia. Ripetere l’operazione per tutte le parti danneggiate della foglia. Copia e incolla questa foglia preparata e posizionala in un’area aperta della tela. Rimuovi i denti usando uno strumento lazo.Iniziare dall’apice della foglia, da uno degli apici del lobo o dal dente più apicale di un frammento di foglia ed effettuare una selezione in corrispondenza di ciascun seno del dente primario lungo la foglia, il lobo o il frammento (Figura 5; vedere Figura 1 supplementare, Figura 2 supplementare per suggerimenti su come distinguere i denti decidui e sussidiari e su come distinguere i denti dai lobi). Assicurarsi di seguire le regole appropriate quando si tagliano i denti (Tabella 2; Figura supplementare 3).NOTA: I denti decidui spesso diventano più piccoli verso la base e l’apice. Dopo aver selezionato il seno apicale del dente più basale, applicare la regola di estensione (Tabella 2; Figura supplementare 4) per tagliare l’ultimo dente della sequenza. Rimuovere i denti tagliando e incollando i denti accanto alla lamina fogliare con i denti rimossi senza toccarla. Se la preparazione ha lobi fogliari aggiuntivi o frammenti che richiedono la rimozione dei denti, ripetere i passaggi precedenti fino a quando tutti i denti non vengono rimossi. Se è stata creata una versione aggiuntiva dell’anta ritagliata originale, eliminare la versione aggiuntiva. Se necessario, ritaglia l’area finale dell’immagine per ridurre le dimensioni del file. Vedere la Figura 3 per un esempio di come dovrebbe apparire l’immagine preparata completata. Scenario 4: una foglia dentata la cui area, o area fogliare, è conservata o può essere ricostruitaAprire il file nel software di elaborazione delle immagini (ad esempio, Adobe Photoshop o GIMP). Ritaglia l’immagine, se necessario, il che aiuta a ridurre le dimensioni finali del file, ma assicurati che la barra della scala sia ancora inclusa. Trippa per quadruplicare la larghezza dell’area di lavoro facendo clic su Immagine > Tela (Photoshop); Immagine > dimensioni della tela (GIMP). Si consiglia di aggiungere una nuova area di disegno a destra o a sinistra dell’area di disegno corrente. Decidi come verrà preparata la foglia. Le misurazioni dell’area/forma della foglia devono essere effettuate su un’intera foglia o su una mezza foglia, decidere quale opzione si tradurrà in misurazioni più accurate. Le misurazioni dei denti devono essere effettuate lungo tutte le sezioni del margine conservato. In alcuni casi, le misurazioni dell’area/forma della foglia possono verificarsi su un sottoinsieme diverso della foglia rispetto al sottoinsieme in cui vengono misurate le variabili dei denti.NOTA: Nell’esempio fornito (Figura 6), è stato deciso che una mezza foglia sarebbe stata ricostruita in modo più affidabile di un’intera foglia. Il margine conservato in basso a destra (>1 dente conservato) è stato incluso per le misurazioni dei denti. Il protocollo seguente per lo scenario 4 segue approssimativamente l’esempio fornito (Figura 6), ma i dettagli possono variare leggermente in diversi contesti di preparazione. Copia la foglia dalla matrice rocciosa, assicurandoti di includere tutto il margine conservato.Traccia il margine della foglia, compreso il picciolo se presente, utilizzando uno strumento lazo. Non rintracciare le parti danneggiate del margine che non saranno incluse nelle misurazioni dell’area/forma proprio perché verranno rimosse (ad esempio, la metà destra della foglia nella Figura 6). Copia e incolla la selezione e posizionala in un’area aperta dell’area di disegno. Prendi in considerazione la possibilità di incollare due copie di questa selezione, una delle quali è una non modificata a cui tornare se necessario per riavviare il processo di preparazione. Se presente, rimuovere il picciolo dalla foglia utilizzando lo strumento lazo.Visivamente, segui il margine della foglia lungo la base fino al punto in cui entra in contatto con il picciolo, che è spesso di colore più scuro e non contiene venature distintive. Posiziona lì un punto lazo. Fai lo stesso sull’altra metà della foglia e posiziona lì il secondo punto.NOTA: Se la base della foglia è simmetrica, la linea sarà ~perpendicolare al picciolo; Se è asimmetrica, la linea sarà ad angolo. Circondi l’intero picciolo per terminare la selezione. Taglia e incolla, o usa lo strumento di spostamento, per posizionare il picciolo vicino alla foglia, ma senza toccarla.NOTA: Per una base fogliare cordata o lobata, il che significa che la base si estende al di sotto del punto in cui il picciolo si attacca alla lamina fogliare, il picciolo ha il potenziale per poggiare sulla base della foglia al di sotto del punto in cui il picciolo si attacca alla lamina fogliare. Fare attenzione a tagliare il picciolo nel punto in cui si attacca, tracciare da vicino il margine del picciolo e riparare il margine danneggiato risultante (Figura supplementare 5). Questo può essere difficile da vedere nella maggior parte dei fossili. Copia e incolla la foglia isolata con il picciolo rimosso per creare una seconda copia per preparare le misurazioni dei denti e posizionarla in un’area aperta della tela. Prepara una versione della foglia per le misure dell’area e della forma della foglia.Se si prepara una mezza foglia, tagliare il materiale fogliare in eccesso utilizzando lo strumento lazo in modo che rimanga solo una mezza foglia completa. Se si prepara una foglia completa, non rimuovere il materiale fogliare. Se necessario, riparare eventuali aree danneggiate lungo il margine utilizzando una linea di colore appropriato utilizzando una linea o uno strumento pennello (in genere una linea nera per uno sfondo bianco). Assicurati che la linea sia abbastanza spessa da essere vista (~1-2 pt di peso) e che colleghi il margine attraverso l’area danneggiata. Preparare una versione della foglia per le misurazioni dei denti.Rimuovi l’area adiacente alle parti danneggiate del margine utilizzando uno strumento lazo.Iniziare la selezione in un punto lungo il margine che delimita la parte danneggiata e tracciare una linea retta da quel punto alla vena principale che è perpendicolare a quella vena principale (Figura 4). Iniziare la selezione dal seno del dente primario conservato più vicino al danno. Ciò garantisce che il fianco di un dente non sia incluso come perimetro interno nelle misurazioni successive e che i denti sussidiari non vengano misurati come se fossero denti primari. Questo potrebbe non essere appropriato se i denti sono distanziati alla distanza, poiché un margine troppo conservato potrebbe finire per essere rimosso (Figura 4). Procedere la selezione lungo la vena maggiore fino a raggiungere il livello con l’altro limite del margine danneggiato e tracciare una linea retta perpendicolare alla vena maggiore fino al margine (Figura 4).NOTA: Per le foglie pennate (Figura 1A), con e senza vene agrofiche (vedi Ellis et al.43 per definizione ed esempi), la vena principale è la vena primaria (cioè la vena mediana). Per le foglie palmate (Figura 1B, D), la vena principale è la vena primaria più vicina (ad esempio, Figura 4B). Per le foglie lobate pennate (Figura 1C), se il danno è localizzato su un lobo pennato, la vena principale è la vena (tipicamente una vena secondaria) che alimenta il lobo. Elimina la parte danneggiata della foglia. Fai lo stesso per tutte le parti danneggiate della foglia. Copia e incolla la versione preparata per le misurazioni dei denti, con le parti danneggiate rimosse, e posizionala in un’area aperta della tela. Rimuovi i denti usando uno strumento lazo.Iniziare dall’apice della foglia, da uno degli apici del lobo o dal dente più apicale di un frammento di foglia ed effettuare una selezione in corrispondenza di ciascun seno del dente primario lungo la foglia, il lobo o il frammento (Figura 5; vedere la Figura 2 supplementare per suggerimenti su come distinguere i denti decidui e sussidiari e su come distinguere i denti dai lobi). Assicurarsi di seguire le regole appropriate quando si tagliano i denti (Tabella 2; Figura supplementare 2).NOTA: I denti decidui spesso diventano più piccoli verso la base e l’apice. Dopo aver selezionato il seno apicale del dente più basale, applicare la regola di estensione (Tabella 2; Figura supplementare 4) per tagliare l’ultimo dente della sequenza. Rimuovere i denti tagliando e incollando i denti accanto alla lamina fogliare con i denti rimossi senza toccarla. Se la preparazione ha lobi fogliari aggiuntivi o frammenti che richiedono la rimozione dei denti, ripetere i passaggi precedenti fino a quando tutti i denti non vengono rimossi. Se è stata creata una versione aggiuntiva della foglia ritagliata originale, eliminare la versione aggiuntiva. Se necessario, ritaglia l’area finale dell’immagine per ridurre le dimensioni del file. Vedere la Figura 3 per un esempio di come dovrebbe apparire l’immagine preparata completata. 3. Misurazione digitale NOTA: Un foglio di calcolo del modello di immissione dati viene fornito come file supplementare 1. Fare riferimento alla Tabella 3 per ulteriori considerazioni nelle fasi di misurazione. Negli scenari 1 e 5, l’unico passaggio richiesto consiste nel registrare lo stato del margine foglia nel foglio di calcolo per l’immissione dati (passaggio 3.5). Aprire il software ImageJ44. Imposta quali misurazioni verranno effettuate automaticamente (fallo una volta dopo l’installazione del programma). Fare clic su Analizza > Imposta misure e selezionare solo Area, Perimetro e Diametro di Feret. Assicurati che le cifre decimali siano impostate su 3. Aprire l’immagine della foglia fossile preparata facendo clic su File > Apri o semplicemente trascinando l’immagine nella barra degli strumenti ImageJ già aperta. Imposta la scala per ogni nuova immagine di foglia.NOTA: Questo è un passaggio critico e deve essere eseguito per ogni nuova immagine di foglia per garantire misurazioni accurate.Fare clic sullo strumento Linea retta. Ingrandisci la barra della scala e disegna la linea retta più lunga possibile attraverso la barra della scala. Fare clic su Analizza > Imposta scala. In distanza nota, inserire la lunghezza misurata in cm (per essere coerente con l’unità utilizzata nel moderno set di dati di calibrazione). Non è necessario modificare l’unità di lunghezza. Fare clic su OK. Contrassegnare l’anta come dentata (0) o intera (1) nel foglio di calcolo per l’inserimento dati. Misurare la larghezza del picciolo se il picciolo è presente. Le misurazioni dovrebbero essere effettuate sulla copia originale della foglia ancora nella matrice rocciosa, in quanto fornisce un contesto molto migliore.NOTA: Se il picciolo non è presente, in alcuni casi, si può misurare la larghezza della vena mediana nella sua posizione basale al posto del picciolo. Tuttavia, questo dovrebbe essere fatto solo se l’intera larghezza della vena mediana è preservata (cioè, non c’è lamina compressa sopra la vena o il fossile conserva il lato abassiale della foglia) e altri esemplari della stessa specie o morfotipo mostrano che la larghezza della vena basale è equivalente alla larghezza del picciolo.Disegna una linea retta perpendicolare al picciolo, dove il picciolo incontra la lamina fogliare, o se il punto di inserimento è asimmetrico, traccia una linea perpendicolare al picciolo nel punto più basale di inserimento. È importante tracciare questa linea con attenzione. Pertanto, si consiglia di ingrandire quest’area della foglia per facilitare il disegno preciso della linea.NOTA: Ci sono circostanze speciali in cui questo passaggio deve essere modificato, incluso se, nel punto più basale di inserimento, esistono danni, tricomi, nettari, spine o altre caratteristiche che impediscono misurazioni accurate della larghezza del picciolo. In questi casi, misurare la larghezza del picciolo nel primo punto al di sotto della caratteristica in cui la misurazione può essere effettuata in modo affidabile. Fare clic su Analizza > misura oppure utilizzare una scorciatoia per misurare la lunghezza della linea tracciata. Disegna la stessa linea sull’immagine per creare una registrazione del punto esatto in cui è stata effettuata la misurazione facendo clic su Modifica > Disegna o utilizzando una scorciatoia. Se necessario, modificare il colore della linea utilizzando uno strumento sulla barra degli strumenti principale (selettore di colori). Una volta tracciata la linea, salva l’immagine, preferibilmente con un nome file modificato. Registrare la lunghezza di questa linea sotto la larghezza del picciolo nel foglio di calcolo per l’immissione dati. Prepara la foglia per ulteriori misurazioni rendendo l’immagine in bianco e nero. A tale scopo, fare clic su Immagine > digitare > 8 bit. Soglia l’immagine facendo clic su Immagine > Regola > soglia o utilizzare la scorciatoia. Si aprirà una casella intitolata Soglia e cambierà parte dell’immagine in rosso. Se la foglia è di colore chiaro e lo sfondo è scuro, fare clic su Sfondo scuro. Regola la soglia utilizzando la barra di scorrimento fino a quando l’interno della foglia è rosso e si distingue dallo sfondo. Questo è un passaggio critico e un luogo facile per produrre dati imprecisi. Assicurati che l’area rossa corrisponda esattamente alla foglia (cioè tutto il perimetro della foglia sia rosso e non di più), ingrandendo alcune sezioni del margine. Gli spazi vuoti di rosso all’interno dell’anta sono accettabili e non influiscono sulle misure.NOTA: Se il contorno della foglia non è ben definito, provare prima a regolare la soglia mentre si ingrandisce per verificare che il contorno della foglia sia rosso. Se uno scarso contrasto tra il fossile e lo sfondo impedisce l’applicazione di una soglia affidabile, utilizzare lo strumento pennello per aggiungere un contorno solido al perimetro della foglia nelle aree in cui il contrasto è troppo scarso. In alternativa, restituisci la foglia al software di elaborazione delle immagini (ad esempio, Adobe Photoshop o GIMP) e regola il contrasto degli strati di foglie isolati o il colore dello sfondo per differenziarli meglio. Misura l’area e la forma delle foglie preparate negli scenari 2 (passaggio 2.1) e 4 (passaggio 2.4).NOTA: Utilizzare la Figura 2 e la Figura 6B come guida per le variabili misurate su quali componenti dell’immagine preparata. Se le foglie sono state preparate nello scenario 3 (passaggio 2.2), saltare questo passaggio e procedere al passaggio 3.11.Misurare la foglia preparata per le misure dell’area e della forma della foglia, a cui dovrebbe essere rimosso solo il picciolo (se era presente un picciolo). Seleziona lo strumento Bacchetta . Fare clic sull’interno della foglia. L’intera foglia dovrebbe essere delineata in giallo: conferma che il contorno è corretto. Effettua le misurazioni facendo clic su Analizza > Misura o utilizzando la scorciatoia. Se l’area misurata è preparata come foglia intera, registrare l’area, il perimetro, il Feret e il Feret minimo nel foglio di calcolo per l’immissione dei dati. Se l’area misurata è preparata come mezza foglia, registrare solo Feret e procedere al passaggio successivo. Se l’area misurata è una mezza foglia, misurare il perimetro centrale artificiale della foglia, che è la lunghezza del perimetro artificiale che risulta dal taglio della foglia a metà (Figura 6B). Se l’area misurata è l’intera foglia, saltare questo passaggio e il passaggio 3.10.5.NOTA: La misurazione del perimetro centrale artificiale consente di calcolare il perimetro della lama a partire da mezze foglie (vedere il passaggio 3.10.5 di seguito). Il perimetro della pala non è utilizzato nelle variabili incluse nelle analisi DiLP e MA ma è utilizzato per altre variabili utili per la caratterizzazione fisiognomica (es. fattore di forma, compattezza; Tabella 1).Seleziona lo strumento linea segmentata facendo clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento linea . Traccia l’intera lunghezza del perimetro centrale artificiale. Fare clic su Analizza > Misura oppure utilizzare la scorciatoia per misurare la lunghezza. Questa misura verrà utilizzata nella formula per calcolare il perimetro della pala sottostante (passaggio 3.10.5). Se l’area misurata è una mezza foglia, modificare le misure man mano che le si inserisce nel foglio di calcolo per l’immissione dei dati moltiplicando l’area per 2, moltiplicando il Feret minimo per 2 e calcolando il perimetro della lama sottraendo prima il perimetro medio artificiale dal perimetro della mezza foglia e quindi moltiplicando per 2 utilizzando la seguente formula:Perimetro della lama = (perimetro – perimetro medio artificiale) x 2 Se è presente un picciolo ritagliato, misurarne l’area. Se non è presente, la misurazione è completata per lo scenario 2, ma procedere al passaggio 3.11 per lo scenario 4.Fare clic sul picciolo ritagliato con lo strumento bacchetta. Il picciolo dovrebbe essere delineato in giallo. Effettua le misurazioni facendo clic su Analizza > Misura o utilizzando la scorciatoia. Registra l’area sotto l’area del picciolo nel foglio di calcolo per l’immissione dei dati. Per lo scenario 2 (passaggio 2.1), la misurazione è ora completata; Per lo scenario 4 (passaggio 2.3), procedere al passaggio successivo. Misura le variabili dei denti per le foglie preparate negli scenari 3 (passaggio 2.2) e 4 (passaggio 2.3).Misura la lama grezza. Con lo strumento bacchetta, selezionare l’interno della lama grezza (cioè la foglia preparata per le misurazioni dei denti che ha ancora i denti; Figura 6B). Dovrebbe essere delineato in giallo. Effettua le misurazioni facendo clic su Analizza > Misura o utilizzando la scorciatoia.NOTA: A seconda di come è stata preparata la foglia, potrebbe essere necessario misurare diverse sezioni disgiunte, sommando le loro aree (ad esempio, Figura 6B). In alternativa, è possibile selezionare più sezioni alla volta selezionando una seconda sezione con lo strumento bacchetta mentre si tiene premuto il tasto Maiusc . Registrare l’area e il perimetro sotto l’area della lama non elaborata e il perimetro della lama non elaborata nel foglio di calcolo per l’immissione dei dati. Misurare la lama grezza interna. Selezionare l’interno della lama grezza interna (cioè la foglia preparata per le misurazioni dei denti a cui sono stati rimossi i denti; Figura 6B). Dovrebbe essere delineato in giallo. Effettua le misurazioni facendo clic su Analizza > Misura o utilizzando la scorciatoia.NOTA: A seconda di come è stata preparata la foglia, potrebbe essere necessario misurare diverse sezioni disgiunte, sommando le loro aree (ad esempio, Figura 6B). In alternativa, è possibile selezionare più sezioni alla volta selezionando una seconda sezione con lo strumento bacchetta mentre si tiene premuto il tasto Maiusc . Registrare l’area e il perimetro sotto l’area interna della lama grezza e il perimetro interno della lama grezza nel foglio di calcolo per l’immissione dei dati. Misurare la lunghezza del perimetro di taglio. Rimuovi la soglia per vedere chiaramente la foglia, fai clic su Reimposta nella casella della soglia o fai clic su Modifica > Annulla: quest’ultimo di solito rimuove anche la conversione in bianco e nero a 8 bit. Seleziona lo strumento linea segmentata e traccia l’intera lunghezza del perimetro di taglio sulla lama grezza. Misurare facendo clic su Analizza > Misura o utilizzando la scorciatoia. Se sono presenti più porzioni, ripetere i passaggi precedenti per misurare la lunghezza del perimetro di taglio di ciascuna porzione. Registrare la lunghezza, o la somma delle lunghezze, sotto la lunghezza del perimetro di taglio nel foglio di calcolo per l’immissione dati.NOTA: Il taglio perimetrale viene introdotto attraverso la preparazione dell’anta rimuovendo i danni. Nella maggior parte dei casi, questo è diverso dal perimetro medio artificiale (Figura 6B). Contare i denti primari e sussidiari, se presenti.NOTA: Vedere la Figura 2 supplementare per suggerimenti su come distinguere tra denti primari e sussidiari.Se la soglia non è già stata rimossa, rimuovila ora. Per rimuovere la soglia, fai clic su Reimposta nella casella di soglia o fai clic su Modifica > Annulla: quest’ultimo di solito rimuove anche la conversione in bianco e nero a 8 bit. Contare il numero di denti decidui (vedere la Figura 2 supplementare per suggerimenti su come distinguere i denti decidui e sussidiari). Selezionare lo strumento Multipunto. Potrebbe essere necessario fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento Punto per selezionare lo strumento Multipunto. Fare clic su ciascun dente deciduo per numerarlo. Per rimuovere un punto selezionato per errore, premete il tasto Alt (sistema operativo Windows) o Comando/cmd o opzione (Mac OS) e contemporaneamente fate clic sul punto. Registrare il numero finale sotto # di denti decidui nel foglio di calcolo per l’inserimento dati. Cancella i conteggi e le annotazioni degli strumenti multipunto facendo clic su Modifica > selezione > Seleziona nessuno o utilizza la scorciatoia da tastiera. Contare il numero totale di denti (cioè tutti i denti primari e sussidiari presenti sulla foglia). Selezionare lo strumento Multipunto. Potrebbe essere necessario fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento Punto per selezionare lo strumento Multipunto. Fare clic su ciascun dente, inclusi quelli primari e secondari, per numerarlo.NOTA: Il conteggio del numero totale di denti, piuttosto che del numero di denti secondari, garantisce che nessun dente venga conteggiato due volte. Il numero totale di denti viene sottratto dal numero di denti decidui per determinare il numero di denti secondari (vedere il passaggio 3.11.7.6). Per rimuovere un punto selezionato per errore, premete il tasto Alt (sistema operativo Windows) o Comando/cmd o opzione (Mac OS) e contemporaneamente fate clic sul punto. Sottrarre il numero di denti decidui dal numero totale di denti per determinare il numero di denti sussidiari. Annotalo sotto # di denti sussidiari nel foglio di calcolo per l’inserimento dati.NOTA: Alcuni utenti preferiscono fare il conteggio dei denti quando preparano le immagini delle foglie piuttosto che durante la misurazione. 4. Esecuzione di analisi nel software R NOTA: I seguenti passaggi richiedono il pacchetto R dilp11. Il foglio di calcolo per l’immissione dei dati viene letto in R e utilizzato dal pacchetto. Fare riferimento alla scheda Istruzioni aggiuntive nel foglio di calcolo per l’immissione dei dati (File supplementare 2). Lo script R può ospitare l’analisi di più siti contemporaneamente o di un singolo sito. Aprire R utilizzando l’ambiente preferito (si consiglia R Studio). Per un’introduzione a R, si veda, ad esempio, https://cran.r-project.org/doc/manuals/r-release/R-intro.pdf. Installare il pacchetto dilp nella sessione R. Per ulteriori informazioni su come installare il pacchetto ed eseguire le funzioni associate, vedere il seguente sito Web: https://cran.r-project.org/package=dilp Leggi nel file .csv contenente i dati fossili del tratto fogliare di angiosperma dicotiledona legnosa (cioè i dati registrati nel foglio di calcolo di inserimento dati). Eseguire la funzione dilp() per le ricostruzioni della temperatura media annua (MAT) e delle precipitazioni medie annuali (MAP) con l’errore associato. I risultati per MAT e MAP sono riportati da un modello di regressione lineare multipla (MLR, cioè DiLP) e da due modelli di regressione lineare singola (SLR, cioè analisi dell’area fogliare e del margine). Esegui la funzione lma() per le ricostruzioni della massa fogliare per area (MA) a livello di morfotipo e sito. Dopo aver eseguito dilp(), si consiglia di verificare la presenza di potenziali problemi di raccolta dei dati e di confermare la qualità dei dati osservando i valori anomali e gli oggetti di errore nei risultati dilp() restituiti. In alternativa, utilizzare la funzione dilp_processing() seguita da dilp_outliers() e dilp_errors(). Risolvi eventuali problemi segnalati facendo riferimento al campione preparato ed eventualmente rimisurandolo. Si consiglia di modificare il file di dati originale e quindi di rileggerlo in R. Determinare se il sito fossile rientra nello spazio multivariato fisionomico fogliare del set di dati di calibrazione utilizzando la funzione dilp_cca().

Representative Results

Un set di dati precedentemente pubblicato di misurazioni della fisionomia fogliare dal sito fossile di McAbee dell’Eocene inferiore nella Columbia Britannica centro-meridionale è stato utilizzato per fornire un esempio di risultati rappresentativi utilizzando sia la fisiognomica fogliare digitale (DiLP) che i metodi di ricostruzione della massa fogliare per area (MA) (Lowe et al.38; dati forniti nel File supplementare 2). Il sito offre l’opportunità di ricostruire il paleoclima e la paleoecologia durante l’intervallo più caldo del Cenozoico (l’Optimum Climatico dell’Eocene inferiore) in un paesaggio montano e vulcanico 38,45,46,47. Gli assemblaggi fossili sono stati campionati da due orizzonti separati in una sequenza lacustre, denominata H1 (28 cm di spessore) e H2 (27 cm di spessore), raggruppati su un intervallo ristretto di stratigrafia utilizzando una tecnica di censimento, per cui tutti gli esemplari a cui è stato assegnato un morfotipo sono stati raccolti o contati38,48. I dati fisionomici delle foglie di McAbee hanno superato i controlli degli errori contrassegnati da dilp_errors() e sette valori anomali contrassegnati da dilp_outliers() sono stati ricontrollati per garantire che i valori rappresentino una vera variazione nei dati e non un errore metodologico. I dati sono stati successivamente analizzati attraverso la funzione dilp() per produrre paleoclima e la funzione lma() per le ricostruzioni della massa fogliare per area. Le ricostruzioni di MA e i limiti inferiore e superiore dei loro intervalli di previsione del 95% sono riportati nella Tabella 4 sia a livello di specie che di sito, utilizzando le equazioni presentate in Royer et al.5 e Butrim et al.10. I valori ricostruiti rientrano nell’intervallo di MA tipico per le specie terrestri moderne (30-330 g/m2)49. Utilizzando le soglie discusse in Royer et al.5, la maggior parte delle specie ha un MA ricostruito che si allinea con la durata della vita delle foglie di <1 anno (≤87 g/m2), alcune ~1 anno (88-128 g/m2), mentre nessuna è tipica di >1 anno (≥129 g/m2). Le ricostruzioni del sito MA media e varianza a McAbee riflettono la prevalenza e la diversità delle strategie economiche fogliari in un sito10,50. Non ci sono differenze importanti tra la media del sito e la varianza tra H1 e H2 e, quindi, non ci sono prove che la composizione e la diversità delle strategie economiche fogliari varino tra i due punti nel tempo. Inoltre, le ricostruzioni della media del sito fatte utilizzando le equazioni di Royer et al.5 e Butrim et al.10 erano molto simili. Le ricostruzioni della temperatura media annua (MAT) e delle precipitazioni medie annuali (MAP) utilizzando le equazioni di regressione lineare multipla (DiLP) e regressione lineare singola (analisi del margine fogliare e dell’area fogliare) presentate in Peppe et al.6 sono mostrate nella Tabella 5. Le stime paleoclimatiche sono dedotte in modo più affidabile se la fisionomia fogliare delle associazioni di foglie fossili si verifica all’interno dello spazio fisiognomico del set di dati di calibrazione. Questo viene valutato attraverso la fase di analisi dell’analisi delle corrispondenze canoniche (CCA) eseguita dalla funzione dilp_cca(). Sia McAbee H1 che H2 rientrano nell’intervallo di fisionomia fogliare osservato nel set di dati di calibrazione (Figura 7A). Se i siti avevano valori ricostruiti che cadevano al di fuori dello spazio di calibrazione, le ricostruzioni paleoclimatiche dovrebbero essere interpretate con cautela (ad esempio, attraverso il confronto con linee di evidenza indipendenti; vedi Peppe et al.6 per ulteriori discussioni). La MAT e la MAP ricostruite sia per H1 che per H2 sono coerenti con un bioma stagionale temperato (Figura 7B, C), che concorda bene con linee di evidenza indipendenti, comprese le inferenze basate sui parenti viventi più prossimi delle comunità floreali e di insetti fossili a McAbee45. Figura 1: Fisionomia delle foglie e terminologia architettonica in questo articolo. (A) Una foglia venata in modo appuntito, non lobata e con margini interi, (B) una foglia con venature palmate, non lobate e dentate, (C) una foglia con venature appuntite, lobate e con margini interi, (D) una foglia con venature palmate, lobate e dentate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Diagramma di flusso del metodo. Un diagramma di flusso che dimostra come le diverse condizioni di conservazione delle foglie e i tipi di foglie determinino quali tipi generali di caratteri fogliari possono essere misurati in modo affidabile (riquadro giallo). Questo determina quale scenario di preparazione verrà seguito nel protocollo e in quali colonne verranno inseriti i dati nel foglio di calcolo per l’immissione dei dati (elenchi puntati). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Diversi scenari di preparazione. Diversi scenari di preparazione che mostrano esempi di immagini completate preparate digitalmente pronte per la fase di misurazione. (A) Scenario 1, foglia marginata intera la cui area, o metà area, non può essere ricostruita, (B) Scenario 5, foglia dentata la cui area, o metà area, non può essere ricostruita e non ha ≥2 denti consecutivi e/o ≥25% della foglia conservata, (C) Scenario 2, foglia marginata intera la cui area, o metà area, è conservata o può essere ricostruita, (D) Scenario 3, una foglia dentata la cui area, o metà area, non può essere ricostruita ma ha ≥2 denti consecutivi e ≥25% della foglia conservata, (E) Scenario 4, una foglia dentata la cui area, o metà area, è conservata o può essere ricostruita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Illustrazione della rimozione dei danni. Illustrazione di come ritagliare il margine danneggiato e l’area fogliare adiacente a tale margine danneggiato. Le linee rosse tratteggiate mostrano come vengono effettuate le selezioni con lo strumento lazo. Si noti che i limiti di danno sono stati intenzionalmente avviati in corrispondenza dei seni paranasali dei denti decidui (vedere la Figura 2 supplementare per aiutare a differenziare i denti primari da quelli sussidiari). (A) Una foglia venata in modo appuntito in cui la selezione è estesa fino alla vena media. (B) Una foglia palmatamente venata in cui la selezione è estesa alla vena primaria più vicina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Illustrazione di un esempio di come tagliare i denti. (A) Le linee rosse tratteggiate mostrano come vengono effettuate le selezioni con lo strumento lazo. Si noti che in questo caso, i denti sono composti, quindi le selezioni sono state effettuate solo tra i seni primari (vedere la Figura 2 supplementare per aiutare a differenziare i denti primari da quelli sussidiari), (B) una prospettiva ingrandita di come è stata effettuata la selezione dei denti, con punti rossi che rappresentano il punto in cui è stato fatto clic con il mouse durante la selezione, (C) la copia della foglia quando i denti sono stati rimossi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Illustrazione dello scenario di preparazione 4. Illustrazione delle decisioni di preparazione e delle fasi di misurazione per una foglia di esempio preparata nello scenario 4. (A) Uno scenario di preparazione in cui è stato deciso che una mezza foglia forniva le misure più affidabili della forma e dell’area della foglia e per le misurazioni dei denti sono stati inclusi margini preservati su entrambe le metà mediali. (B) Un esempio che dimostri quali variabili sono misurate sui vari componenti della foglia preparata. Il testo in grassetto evidenzia le misure necessarie per le analisi DiLP e MA , mentre il testo non in grassetto (perimetro della lama, Feret minimo e perimetro medio artificiale) evidenzia le misure che non sono necessarie ma utili per ulteriori caratterizzazioni fisionomiche (ad esempio, fattore di forma e compattezza; Tabella 1). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Risultati rappresentativi. Risultati di due orizzonti fossili (H1 e H2) campionati presso i McAbee Fossil Beds dell’Eocene inferiore di Lowe et al.38. (A) Analisi delle corrispondenze canoniche che mostrano la rappresentazione della fisionomia fogliare multivariata nel dataset di calibrazione. I dati di calibrazione sono di Peppe et al.6. La fisionomia fogliare dei due orizzonti di McAbee è sovrapposta e si verifica all’interno dello spazio di calibrazione. (B e C) Stime della temperatura e delle precipitazioni, e la loro incertezza associata (errori standard dei modelli), utilizzando le equazioni presentate in Peppe et al.6 dei due orizzonti di McAbee sovrapposti su un diagramma del bioma di Whittaker. (B) Stime ricostruite utilizzando i modelli di regressione lineare multipla (MLR) della Digital Leaf Physiognomy (DiLP), (C) Stime ricostruite utilizzando le equazioni di regressione lineare singola (SLR) dell’analisi dell’area fogliare (LAA) e dell’analisi del margine fogliare (LMA) dei due orizzonti di McAbee sovrapposti a un diagramma del bioma di Whittaker. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tabella 1: Variabili fisionomiche fogliari. Variabili che vengono misurate e/o calcolate e applicate nei modelli predittivi che utilizzano questo protocollo per ricostruire la massa secca fogliare per area (MA), la temperatura media annua (MAT) e le precipitazioni medie annuali (MAP). MAT e MAP sono ricostruiti con le equazioni presentate in Peppe et al.6 utilizzando un approccio multivariato per la fisiognomica fogliare digitale (DiLP) e approcci univariati per l’analisi del margine fogliare (LMA) e l’analisi dell’area fogliare (LAA). Le variabili elencate come Altro non sono utilizzate nelleanalisi M, A, DiLP, LMA e LAA, ma sono comunque misurate e calcolate utilizzando questo protocollo perché sono facili da implementare e forniscono utili caratterizzazioni della fisionomia fogliare. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 2: Ulteriori considerazioni e spiegazioni per le fasi di preparazione. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 3: Ulteriori considerazioni e spiegazioni per le fasi di misurazione. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 4: Ricostruzioni della massa secca fogliare per area (MA) e limiti superiori e inferiori associati degli intervalli di previsione del 95% per i letti fossili di McAbee da Lowe et al.38. Le ricostruzioni sono fatte per la media del morfotipo5, la media del sito 5,10 e la varianza del sito10. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 5: Ricostruzioni delle precipitazioni medie annuali temperate (MAT) e medie annuali (MAP) per Horizon 1 (H1) e 2 (H2) nei letti fossili di McAbee dell’Eocene inferiore utilizzando le regressioni lineari multiple (MLR) della Digital Leaf Physiognomy (DiLP) e le regressioni lineari singole (SLR) dell’analisi del margine fogliare (LMA) e dell’analisi dell’area fogliare (LAA) presentate in Peppe et al.6. Clicca qui per scaricare questa tabella. Figura supplementare 1: Foglia di Quercus rubra della foresta di Harvard che illustra la regola del lobo rispetto al dente. I segmenti di linea p e d sono definiti nel testo. Barre della scala = 1 cm. Clicca qui per scaricare questo file. Figura 2 supplementare: Foglia di Betula lutea della foresta di Harvard che illustra le regole per differenziare i denti sussidiari dai denti decidui. Il segmento fogliare isolato è stato ingrandito di 2 volte. La linea blu collega i seni con il maggior grado di incisione (cioè i seni primari) e i denti associati a questi seni sono considerati primari (frecce blu). I punti rossi segnano i denti che possono essere differenziati come sussidiari perché i loro seni apicali sono incisi in misura minore. I denti indicati dalle frecce rosse hanno un grado di incisione simile rispetto ai denti primari, ma possono essere identificati come sussidiari da una vena principale relativamente più sottile rispetto ai denti decidui. Barre della scala = 1 cm. Clicca qui per scaricare questo file. Figura 3 supplementare: Illustrazione della selezione dei denti, della regola del lobo pennato e della regola di priorità del lobo. (A) Selezione dei denti per una foglia di Hamamelis virginiana da Huyck Preserve. Le aree scure corrispondono al tessuto fogliare che è incluso nella selezione totale dei denti perché i denti sussidiari sono differenziati dai denti decidui. (B) La foglia di Quercus alba dell’IES illustra la regola della priorità del lobo. Le aree scure sono misurate come lobi e quelle non scure sono misurate come denti, ma tutte le proiezioni sono considerate lobi secondo la regola della priorità dei lobi. Barre della scala = 1 cm. Clicca qui per scaricare questo file. Figura 4 supplementare: Foglia di Acer saccharum della foresta nazionale di Allegheny che illustra le regole per l’estensione e il dente solitario. Le linee tratteggiate rappresentano le selezioni dei denti. La linea continua rappresenta l’asse di simmetria per il dente associato. L’area nera è un peso utilizzato per appiattire le foglie per la fotografia. Barre della scala = 1 cm. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 5: Illustrazione del modo ideale per ritagliare un picciolo posizionato sopra una base cordata. Clicca qui per scaricare questo file. File supplementare 1: Modello di inserimento dati per tutte le variabili fisionomiche digitali delle foglie misurate. Questo file non deve essere modificato, perché verrà usato come file di input per il pacchetto R. Clicca qui per scaricare questo file. File supplementare 2: Esempi di dati dai letti fossili di McAbee da Lowe et al.38. Questi dati sono stati utilizzati per generare la Figura 7 e per la discussione di risultati rappresentativi. Clicca qui per scaricare questo file. File supplementare 3: Documento di regole per la fisionomia delle foglie digitali fossili. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Questo articolo presenta come i tratti continui della fisionomia fogliare possano essere misurati su foglie fossili di angiosperme di dicotiledoni legnosi e successivamente applicati a proxy sviluppati da moderni dati di calibrazione per ricostruire il paleoclima e la paleoecologia. Ciò richiede che si presti attenzione ad allineare i passaggi metodologici con quelli rappresentati nei set di dati di calibrazione proxy 5,6,10. Questa considerazione inizia prima dell’applicazione di questo protocollo durante la raccolta di foglie fossili, in particolare per quanto riguarda la dimensione del campione. Si raccomanda di raggruppare le associazioni di foglie fossili in un intervallo di stratigrafia il più ristretto possibile per ottenere un numero adeguato di esemplari e morfotipi misurabili per ridurre al minimo la media dei tempi. Si raccomanda inoltre di limitare la ricostruzione paleoclimatica a siti con almeno 350 esemplari identificabili e almeno 15-20 morfotipi di angiosperme dicotiledoni legnose 19,51,52. Inoltre, quando si scelgono le foglie per le analisi, si raccomanda di misurare il maggior numero possibile di foglie per morfotipo e, come minimo, di scegliere campioni che rappresentino la variabilità della fisionomia delle foglie all’interno di un morfotipo.

È necessario prestare ulteriore attenzione durante l’implementazione delle sezioni di preparazione e misurazione per rimanere coerenti con il set di dati di calibrazione. I passaggi eseguiti durante le fasi di preparazione hanno il massimo potenziale di soggettività e risultati diversi tra gli utenti. Tuttavia, se il protocollo viene seguito deliberatamente e si fa spesso riferimento alle tabelle di considerazioni aggiuntive (Tabella 2, Tabella 3) e al documento delle regole (File supplementare 3), questo metodo si traduce in misurazioni oggettive e riproducibili della fisionomia delle foglie. Per gli utenti che non conoscono il metodo, si consiglia di confermare che le foglie siano state preparate correttamente con qualcuno che ha più esperienza. Particolare attenzione deve essere prestata quando si misura la larghezza del picciolo per le ricostruzioni MA . Poiché questi valori sono al quadrato, l’imprecisione nelle misurazioni diventerà esagerata. Una conservazione incompleta e danni possono alterare le dimensioni del picciolo e devono essere accuratamente evitati.

Ci sono alcune limitazioni a questi metodi che vale la pena notare. Ancora più importante, le ricostruzioni proxy incluse nel pacchetto dilp R sono solo per angiosperme dicotiledoni legnose e, quindi, possono escludere altri gruppi di piante che erano componenti importanti delle antiche comunità. Tuttavia, sono stati pubblicati ulteriori proxy basati sul picciolo fogliare per il livello di specie MA per le gimnosperme picciolate e a foglia larga 5,8, le angiosperme erbacee8 e le felci9, che un utente potrebbe incorporare separatamente se lo desidera. L’esclusione di gruppi di piante prominenti nelle comunità al di là delle angiosperme dicotiledoni legnose è probabilmente più impattante per le ricostruzioni della media e della varianza MA a livello di sito, in quanto forniranno una prospettiva incompleta delle strategie economiche all’interno dell’intera comunità. La storia filogenetica influenza la presenza dei denti fogliari23, introducendo il potenziale che l’analisi delle comunità fossili con una nuova composizione tassonomica può infondere incertezza nelle stime risultanti, sebbene la realizzazione di questa potenziale influenza non sia stata ancora testata e dimostrata.

Anche le foglie fossili devono essere adeguatamente conservate per incorporare misurazioni quantitative della fisionomia delle foglie oltre lo stato marginale. Per DiLP, questo è particolarmente vero per le foglie a margine intero, in quanto possono fornire informazioni oltre lo stato di margine solo se l’intera foglia, o mezza foglia, è conservata o può essere ricostruita. Allo stesso modo, le foglie possono essere incorporate nelle ricostruzioni MA solo se (1) entrambi i loro piccioli al momento della sua inserzione nella lamina fogliare sono conservati o, in casi specifici, se la base della foglia e la porzione più basale della vena mediana sono conservate (vedi Nota al punto 3.6), e (2) se la dimensione della foglia può essere stimata, attraverso la misurazione dell’intera foglia o la ricostruzione di mezza foglia. Ciò significa che alcuni morfotipi possono essere esclusi del tutto dalle analisi MA livello di sito. Infine, il tempo è un limite con questo protocollo, poiché le alternative univariate per le ricostruzioni paleoclimatiche richiedono relativamente meno tempo per essere prodotte.

Nonostante queste limitazioni, l’uso dei metodi di ricostruzione DiLP e MA presenta ancora diversi vantaggi rispetto ad altri metodi. Le ricostruzioni MA sono uno dei pochi modi per ricostruire le strategie economiche delle foglie nella documentazione fossile, e l’uso di misurazioni bidimensionali della larghezza del picciolo e dell’area fogliare consente di eseguire ricostruzioni utilizzando fossili di foglie comuni da impressione/compressione. Per DiLP, l’incorporazione di più misurazioni continue che sono funzionalmente collegate al clima migliora la riproducibilità delle misurazioni e l’accuratezza delle ricostruzioni climatiche risultanti 6,13. Questo protocollo è stato progettato per tenere conto della natura incompleta della documentazione fossile, consentendo di effettuare misurazioni della dentatura delle foglie utilizzando frammenti di foglie. Sebbene le misurazioni continue dell’area fogliare forniscano maggiori informazioni sulla dimensione delle foglie, le stime della MAP DiLP possono essere integrate da quelle che utilizzano le classi di dimensione delle foglie nel tentativo di aumentare la dimensione del campione16,53 o attraverso l’incorporazione di stime della scala delle vene dell’area fogliare 42,54,55. Come per la maggior parte dei metodi coinvolti, l’efficienza in termini di tempo di questo protocollo migliorerà man mano che l’utente diventa più esperto e sicuro, in particolare nelle fasi di preparazione. Il fatto che le misurazioni DiLP a livello di sito siano state effettuate seguendo questo protocollo per >150 moderni 6,10,56 e almeno 22 assemblaggi fossili fino ad oggi attesta la sua fattibilità 6,38,39,40,41,42. Infine, le misurazioni complete della fisionomia fogliare hanno applicazioni che vanno oltre quelle discusse qui e possono essere utili per descrivere altri aspetti dell’ecologia, della fisiologia, dell’evoluzione e dello sviluppo delle piante, con applicazione sia agli studi moderni56 che a quelli paleo40.

In sintesi, l’implementazione dei metodi descritti in questo articolo consente all’utente di ricostruire il paleoclima e la paleoecologia utilizzando metodi robusti e riproducibili. Questi metodi forniscono un’importante opportunità per mostrare esempi passati di risposte climatiche ed ecosistemiche alle perturbazioni ambientali e per fornire ulteriori informazioni sulle complesse interazioni dei sistemi naturali della Terra.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AJL ringrazia il Team Leaf universitario 2020-2022 dell’Università di Washington per la motivazione e i suggerimenti per la creazione di materiali di formazione efficaci per DiLP. AGF, AB, DJP e DLR ringraziano i numerosi studenti universitari della Wesleyan University e della Baylor University che hanno misurato le foglie moderne e fossili e il cui contributo è stato inestimabile nella modifica e nell’aggiornamento di questo protocollo. Gli autori ringraziano il PBot Quantitative Traits Working Group e il team PBOT per aver incoraggiato il lavoro di formalizzazione di questo protocollo per renderlo più accessibile a comunità più ampie. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (sovvenzione EAR-0742363 a DLR, sovvenzione EAR-132552 a DJP) e Baylor University (Young Investigator Development Program a DJP). Ringraziamo due revisori anonimi e l’editor della revisione per il feedback che ha contribuito a migliorare la chiarezza e la completezza di questo protocollo.

Materials

Copy stand or tripod For fossil photography
Digital camera For fossil photography, high resolution camera preferred
Image editing software  For digital preperation. Examples include Adobe Photoshop and GIMP, the latter of which is free (https://www.gimp.org/)
ImageJ software IJ1.46pr For making digital measurments, free software (https://imagej.net/ij/index.html)
Microsoft Excel Microsoft Or similar software for data entry
R software The R foundation For running provided R script (https://www.r-project.org/). R studio offers a user friendly R enviornment (https://posit.co/download/rstudio-desktop/). Both are free.
dilp R Package Can be installed following instructions here: https://github.com/mjbutrim/dilp
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Lowe, A. J., Flynn, A. G., Butrim, M. J., Baumgartner, A., Royer, D. L., Peppe, D. J. Reconstructing Terrestrial Paleoclimate and Paleoecology with Fossil Leaves Using Digital Leaf Physiognomy and Leaf Mass Per Area. J. Vis. Exp. (212), e66838, doi:10.3791/66838 (2024).
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