Ters Translasyonel Beyin Araştırmaları için İnsan Kanı Kaynaklı Mikroglia Benzeri Hücrelerin Mühendisliği
Summary
Bu çalışma, beyin iltihabının dolaylı olarak değerlendirilmesini sağlayan insan monosit türevli mikroglia benzeri (iMG) hücrelerin kurulması için yeni bir yaklaşımı tanımlamaktadır. Bu, beynin potansiyel iltihabına ve ilişkili nöropsikiyatrik bozukluklara odaklanan araştırmalar için faydalı olabilecek bir hücresel model sunar.
Abstract
Hayvan modelleri kullanılarak yapılan son araştırmalar, mikroglianın çeşitli nöropsikiyatrik ve fiziksel hastalıklarda önemli immünolojik modülatörler olarak önemini vurgulamıştır. Postmortem beyin analizi ve pozitron emisyon tomografisi görüntüleme, insan hastalarda mikroglial aktivasyonu değerlendiren temsili araştırma yöntemleridir; Bulgular, çeşitli nöropsikiyatrik bozukluklar ve kronik ağrı ile başvuran hastaların beyinlerinde mikroglia aktivasyonunu ortaya koymuştur. Bununla birlikte, yukarıda bahsedilen teknik, mikroglial aktivasyonun sınırlı yönlerinin değerlendirilmesini sadece kolaylaştırır.
Beyin biyopsisi ve indüklenmiş pluripotent kök hücre tekniği yerine, başlangıçta taze türetilmiş insan periferik kan monositlerinden doğrudan indüklenmiş mikroglia benzeri (iMG) hücreleri, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör ve interlökin 34 ile 2 hafta boyunca takviye ederek üretmek için bir teknik geliştirdik. Bu iMG hücreleri, hücresel düzeyde stres stimülasyonunu takiben fagositik kapasite ve sitokin salınımları ile ilgili dinamik morfolojik ve moleküler düzeyde analizler yapmak için kullanılabilir. Son zamanlarda, insan iMG hücreleri ile beyin primer mikroglia arasındaki benzerliği doğrulamak için kapsamlı transkriptom analizi kullanılmıştır.
Hastadan türetilen iMG hücreleri, insan beynindeki mikroglial aktivasyonu tahmin etmek için anahtar vekil belirteçler olarak hizmet edebilir ve Nasu-Hakola hastalığı, fibromiyalji, bipolar bozukluk ve Moyamoya hastalığı olan hastalarda daha önce bilinmeyen dinamik mikroglia patofizyolojisinin ortaya çıkarılmasına yardımcı olmuştur. Bu nedenle, iMG tabanlı teknik, değerli bir ters çeviri aracı olarak hizmet eder ve çeşitli zihinsel ve fiziksel hastalıklarda mikroglianın moleküler patofizyolojisini dinamik olarak aydınlatmak için yeni bilgiler sağlar.
Introduction
Son yıllarda, beyin inflamasyonunun çeşitli beyin ve nöropsikiyatrik bozuklukların patofizyolojisinde önemli roller üstlendiği öne sürülmüştür; mikroglia, insan ölüm sonrası beyin analizi ve pozitron emisyon tomografisi (PET) tabanlı biyo-görüntüleme teknikleri 1,2,3,4 ile anahtar immünomodülatör hücreler olarak vurgulanmıştır. Postmortem beyin ve PET görüntüleme analizleri önemli bulgular ortaya koymaktadır; Bununla birlikte, bu yaklaşımlar, beyindeki insan mikrogliasının dinamik moleküler aktivitelerini bir bütün olarak yakalamak açısından verimsizdir. Bu nedenle, insan mikroglial fonksiyonlarının ve işlev bozukluklarının moleküler ve hücresel düzeyde kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için yeni stratejiler gereklidir.
2014 yılında, 2016’da insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) türevi mikroglia benzeri hücrelerin ilk yayınlanmasından önce, doğrudan indüklenmiş mikroglia benzeri (iMG) hücreler 5,6 üretmek için orijinal olarak yeni bir teknik tasarladık7. Sadece 2 haftada, sitokinleri, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktörü (GM-CSF) ve interlökin 34’ü (IL-34) optimize ederek insan periferik kan monositlerini başarıyla iMG hücrelerine dönüştürdük. Bu tekniği geliştirdiğimizde, iPS hücrelerinden veya fibroblastlardan nöronal hücreleri indüklemenin yenilikçi yeniden programlama yöntemi dünyada hakim olmaya yeni başlıyordu 8,9,10,11. Bununla birlikte, o zamanlar, iPS’den türetilmiş mikroglial hücreleri indüklemek için bir yöntem henüz rapor edilmemişti ve insan somatik hücre türevli bir mikroglial modelin oluşturulması arzu ediliyordu. Makrofaj koloni uyarıcı faktör olan GM-CSF ve IL-34 gibi sitokinlerin mikroglia 12,13,14,15’in gelişimi ve bakımı için gerekli olduğu bildirildiğinden, bu sitokinlerin bir kombinasyonunun kan monositlerinden bir mikroglial hücresel model oluşturmak için doğrudan uygulanabileceğini varsaydık. Son olarak, GM-CSF ve IL-345’i birleştirerek monositlerden türetilen bir mikroglia modeli geliştirmeyi başardık. Ek olarak, bu sitokin kombinasyonlarının bazıları, iPS hücrelerinden 7,16 mikroglia’yı indüklemek için de kullanılır ve mikroglial özelliklerin elde edilmesinde önemli bir faktör olduğu varsayılmaktadır.
iPSC yöntemlerinin aksine, iMG hücreleri herhangi bir genetik modifikasyon gerektirmez ve basit kimyasal indüksiyonla çok kısa sürede üretilebilir, bu da daha düşük zaman ve finansal maliyetlerle sonuçlanır. Ayrıca, iMG hücreleri genetik yeniden programlama gerektirmez, bu nedenle iMG hücrelerinin sadece özellikleri değil, aynı zamanda insan mikroglia durumlarını da değerlendirmek için güçlü vekil hücreler olduğuna inanıyoruz. 2014 yılında iMG tekniği ile ilgili ilk makalede, iMG hücrelerinin, monositlerden ve makrofajlardan farklı olabilen bir insan mikroglia fenotipi sergilediğini doğruladık. Örneğin, iMG hücreleri, monositlere ve transmembran protein 119 (TMEM 119) ve purinerjik reseptör P2RY12 5,17 dahil olmak üzere monositlere ve tipik mikroglia belirteçlerine göre CX3C kemokin reseptörü 1 (CX3CR1) ve CC kemokin reseptörü tip 2’nin (CCR2) aşırı ekspresyon oranını sergiledi. Son zamanlarda, periferik kan kaynaklı iMG hücrelerinin, beyin ameliyatı geçiren aynı hastada iyi bilinen mikroglial belirteçlerin gen ekspresyon profilinde beyin mikrogliasına benzediğini doğruladık18. IMG hücreleri, fagositoz ve sitokin üretimi gibi moleküler düzeyde dinamik fonksiyonlar için analiz edilebilir ve ölüm sonrası beyin araştırmalarının ve PET çalışmalarının dezavantajlarını telafi etmesi beklenir.
Nasu-Hakola hastalığı5, fibromiyalji19, bipolar bozukluk20,21 veya Moyamoya hastalığı22 tanısı alan hastalarda mikrogliayı içeren daha önce bilinmeyen dinamik patofizyolojik mekanizmalar keşfettik. Ayrıca, orijinal metodolojimize dayanarak, çeşitli laboratuvarlar iMG hücrelerini (bazı laboratuvarlar bu hücrelere alternatif isimler belirlemiştir) çok önemli bir ters çeviri araştırma aracı olarak kullanmıştır 23,24,25,26,27. Sellgren ve ark. önerilerimize uygun olarak iMG hücrelerini başarıyla ürettiler ve bu hücrelerin insan beyni mikroglia23’e çok benzediğini ortaya çıkaran bir mikroarray analizi yaptılar. Son zamanlarda, RNA dizilimi18 kullanarak insan iMG hücreleri ile beyin birincil mikroglia arasındaki benzerliği doğruladık.
Bu çalışma, nöropsikiyatrik hastalıklara odaklanan ters translasyonel araştırmaları kolaylaştırmak için insan periferik kanından iMG hücreleri üretme metodolojisini belgelemeyi amaçladı. Bu teknik, gen transfer aparatı veya yetkin personeli olmayan yetersiz donanımlı laboratuvarlarda bile, kısa sürede zahmetsizce mikroglial hücresel modeller üretebilen makul bir analitik araç olarak potansiyel sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
iMG hücrelerini kullanan analitik teknikler, güçlü ters translasyonel araştırma araçları olarak hizmet edebilir 5,6. Yeterli miktarda insan iMG hücresi üretmek için, deneyciler çalışmalarını belirli konuları dikkate alarak tasarlamalıdır. İnsanlardan alınan kan örnekleri son derece hassastır; Sonuç olarak, elde edilen numuneler, kontaminasyonu önlemek için hızlı işlemeyi ve titiz işlemeyi garanti eder. Spesifik olarak, kan örnekleri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, aşağıdaki Bilimsel Araştırma Hibeleri tarafından kısmen desteklenmiştir: (1) Japonya Bilimi Teşvik Derneği (KAKENHI; JP18H04042, JP19K21591, JP20H01773 ve JP22H00494 TAK’a, JP22H03000 M.O.’ya); (2) Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı (AMED; JP21wm0425010 için TAK, JP22dk0207065 için M.O.) ve (3) Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı CREST (TAK’a JPMJCR22N5). Finansman kuruluşları, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makale hazırlama konularında hiçbir rol üstlenmediler. İngilizce dil düzenlemesi için Editage’a (www.editage.jp) teşekkür ederiz.
Materials
| 0.1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 30-5140-5 | |
| 4% paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 09154-14 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | gibco | 15240-062 | described as "antibiotic-antimycotic solution" |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer" |
| CD11b MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130–049-601 | |
| DAPI solution | DOJINDO | 28718-90-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Nacalai Tesque | 14249-24 | described as "PBS (−)" |
| Fetal Bovine Serum | biowest | S1760-500 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | described as "density gradient medium" |
| Human FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130–059-901 | |
| Leucosep | Greiner Bio-One | 227290 | described as "density gradient centrifugation tube" |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | described as "magnetic column" |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution" |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | described as "magnetic stand" |
| Penicillin-Streptomycin | Nacalai Tesque | 26253–84 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | described as "mounting media" |
| recombinant human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM | |
| recombinant human IL-34 | R&D Systems | 5265-IL | |
| RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium) | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | described as "basal induction medium" |
| RPMI-1640 | Nacalai Tesque | 30264-56 | |
| Antibodies | |||
| anti-P2RY12 antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | primary antibody, rabbit, 1:100 |
| anti-TMEM119 antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | primary antibody, rabbit, 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | invitrogen | A-11011 | secondary antibody, rabbit, 1:1000 |
References
- Steiner, J., et al. Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide. J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).
- Setiawan, E., et al. Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study. Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).
- Holmes, S. E., et al. Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study. Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).
- Meyer, J. H., et al. Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets. Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).
- Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Sci Rep. 4, 4957 (2014).
- Kato, T. A., Ohgidani, M., Kanba, S. Method of producing microglial cells. France patent EP. , (2023).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Mattis, V. B., Svendsen, C. N. Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology. Lancet Neurol. 10 (4), 383-394 (2011).
- Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10343-10348 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nat Immunol. 13 (8), 753-760 (2012).
- Aloisi, F., De Simone, R., Columba-Cabezas, S., Penna, G., Adorini, L. Functional maturation of adult mouse resting microglia into an APC is promoted by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interaction with Th1 cells. J Immunol. 164 (4), 1705-1712 (2000).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6 (10), e26317 (2011).
- Nandi, S., et al. The CSF-1 receptor ligands IL-34 and CSF-1 exhibit distinct developmental brain expression patterns and regulate neural progenitor cell maintenance and maturation. Dev Biol. 367 (2), 100-113 (2012).
- Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Rep. 8 (6), 1516-1524 (2017).
- Yonemoto, K., et al. Heterogeneity and mitochondrial vulnerability configurate the divergent immunoreactivity of human induced microglia-like cells. Clin Immunol. 255, 109756 (2023).
- Tanaka, S., et al. CD206 expression in induced microglia-like cells from peripheral blood as a surrogate biomarker for the specific immune microenvironment of neurosurgical diseases including glioma. Front Immunol. 12, 2424-2424 (2021).
- Ohgidani, M., et al. Fibromyalgia and microglial TNF-alpha: Translational research using human blood induced microglia-like cells. Sci Rep. 7 (1), 11882 (2017).
- Ohgidani, M., et al. Microglial CD206 gene has potential as a state marker of bipolar disorder. Front Immunol. 7, 676 (2016).
- Ohgidani, M., et al. A case of bipolar disorder with AIF1 (coding gene of Iba-1) deletion: A pilot in vitro analysis using blood-derived microglia-like cells. Psychiatry Clin Neurosci. 77 (2), 128-130 (2023).
- Shirozu, N., et al. Angiogenic and inflammatory responses in human induced microglia-like (iMG) cells from patients with Moyamoya disease. Sci Rep. 13 (1), 14842 (2023).
- Sellgren, C. M., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Mol Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Sellgren, C. M., et al. Increased synapse elimination by microglia in schizophrenia patient-derived models of synaptic pruning. Nat Neurosci. 22 (3), 374-385 (2019).
- Banerjee, A., et al. Validation of induced microglia-like cells (iMG Cells) for future studies of brain diseases. Front Cell Neurosci. 15, 629279 (2021).
- You, M. J., et al. A molecular characterization and clinical relevance of microglia-like cells derived from patients with panic disorder. Transl Psychiatry. 13 (1), 48 (2023).
- Rocha, N. P., et al. Microglia activation in basal ganglia is a late event in Huntington disease pathophysiology. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 8 (3), e984 (2021).
- Sargeant, T. J., Fourrier, C. Human monocyte-derived microglia-like cell models: A review of the benefits, limitations and recommendations. Brain Behav Immun. 107, 98-109 (2023).
- Lannes, N., et al. Interactions of human microglia cells with Japanese encephalitis virus. Virol J. 14 (1), 8 (2017).
- Ryan, K. J., et al. A human microglia-like cellular model for assessing the effects of neurodegenerative disease gene variants. Sci Transl Med. 9 (421), 7635 (2017).
- Etemad, S., Zamin, R. M., Ruitenberg, M. J., Filgueira, L. A novel in vitro human microglia model: characterization of human monocyte-derived microglia. J Neurosci Methods. 209 (1), 79-89 (2012).
- Bortolotti, D., Gentili, V., Rotola, A., Caselli, E., Rizzo, R. HHV-6A infection induces amyloid-beta expression and activation of microglial cells. Alzheimers Res Ther. 11 (1), 104 (2019).
- Ormel, P. R., et al. A characterization of the molecular phenotype and inflammatory response of schizophrenia patient-derived microglia-like cells. Brain Behav Immun. 90, 196-207 (2020).
- Akiyama, H., et al. Expression of HIV-1 intron-containing RNA in microglia induces inflammatory responses. J Virol. 95 (5), e01386-e01420 (2021).
- Nielsen, M. C., Andersen, M. N., Moller, H. J. Monocyte isolation techniques significantly impact the phenotype of both isolated monocytes and derived macrophages in vitro. Immunology. 159 (1), 63-74 (2020).
- Kelly, A., Grabiec, A. M., Travis, M. A. Culture of human monocyte-derived macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 1-11 (2018).
