Ingegnerizzazione di cellule simili alla microglia indotte dal sangue umano per la ricerca cerebrale traslazionale inversa
Summary
Questo studio delinea un nuovo approccio per la creazione di cellule simili alla microglia (iMG) derivate da monociti umani che consentono la valutazione indiretta dell’infiammazione cerebrale. Questo presenta un modello cellulare che può essere utile per la ricerca incentrata sulla potenziale infiammazione del cervello e sui disturbi neuropsichiatrici associati.
Abstract
Recenti indagini su modelli animali hanno evidenziato l’importanza delle microglia come modulatori immunologici cruciali in varie malattie neuropsichiatriche e fisiche. L’analisi cerebrale post mortem e l’imaging con tomografia a emissione di positroni sono metodi di ricerca rappresentativi che valutano l’attivazione microgliale nei pazienti umani; I risultati hanno rivelato l’attivazione della microglia nel cervello di pazienti che presentano vari disturbi neuropsichiatrici e dolore cronico. Tuttavia, la tecnica di cui sopra facilita semplicemente la valutazione di aspetti limitati dell’attivazione microgliale.
Al posto della biopsia cerebrale e della tecnica delle cellule staminali pluripotenti indotte, abbiamo inizialmente ideato una tecnica per generare cellule simili alla microglia indotte direttamente (iMG) da monociti del sangue periferico umano appena derivati, integrandole con un fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi e interleuchina 34 per 2 settimane. Queste cellule iMG possono essere impiegate per eseguire analisi morfologiche dinamiche e a livello molecolare riguardanti la capacità fagocitaria e il rilascio di citochine in seguito a stimolazione da stress a livello cellulare. Recentemente, l’analisi completa del trascrittoma è stata utilizzata per verificare la somiglianza tra le cellule iMG umane e la microglia primaria cerebrale.
Le cellule iMG derivate dal paziente possono fungere da marcatori surrogati chiave per prevedere l’attivazione della microglia nel cervello umano e hanno contribuito alla rivelazione della fisiopatologia dinamica precedentemente sconosciuta della microglia in pazienti con malattia di Nasu-Hakola, fibromialgia, disturbo bipolare e malattia di Moyamoya. Pertanto, la tecnica basata su iMG funge da prezioso strumento di traduzione inversa e fornisce nuove intuizioni per chiarire la fisiopatologia molecolare della microglia in una varietà di malattie mentali e fisiche.
Introduction
Negli ultimi anni, è stato suggerito che l’infiammazione cerebrale assuma un ruolo fondamentale nella fisiopatologia di vari disturbi cerebrali e neuropsichiatrici; le microglia sono state evidenziate come cellule immunomodulatorie chiave dall’analisi cerebrale post mortem umana e dalle tecniche di bio-imaging basate sulla tomografia a emissione di positroni (PET) 1,2,3,4. Le analisi di imaging cerebrale e PET postmortem rivelano risultati significativi; Tuttavia, questi approcci sono inefficienti in termini di cattura delle attività molecolari dinamiche delle microglia umane nel cervello nella loro interezza. Pertanto, sono necessarie nuove strategie per consentire la valutazione completa delle funzioni e delle disfunzioni della microglia umana a livello molecolare e cellulare.
Nel 2014, abbiamo originariamente ingegnerizzato una nuova tecnica per produrre cellule simili alla microglia indotte direttamente (iMG) 5,6, prima della prima pubblicazione di cellule simili alla microglia derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSC) nel 20167. In sole 2 settimane, abbiamo convertito con successo i monociti del sangue periferico umano in cellule iMG ottimizzando le citochine, il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) e l’interleuchina 34 (IL-34). Quando abbiamo sviluppato questa tecnica, l’innovativo metodo di riprogrammazione per indurre cellule neuronali da cellule iPS o fibroblasti stava appena iniziando a prevalere nel mondo 8,9,10,11. Tuttavia, a quel tempo, non era ancora stato riportato un metodo per indurre cellule microgliali derivate da iPS e si desiderava la generazione di un modello microgliale derivato da cellule somatiche umane. Poiché citochine come GM-CSF e IL-34, fattore stimolante le colonie di macrofagi, sono state riportate come necessarie per lo sviluppo e il mantenimento della microglia 12,13,14,15, abbiamo ipotizzato che una combinazione di queste citochine potrebbe essere applicata direttamente per generare un modello cellulare microgliale da monociti del sangue. Infine, siamo riusciti a sviluppare un modello di microglia derivato dai monociti combinando GM-CSF e IL-345. Inoltre, alcune di queste combinazioni di citochine sono impiegate anche per indurre la microglia dalle cellule iPS 7,16 e si presume che siano un fattore importante nell’acquisizione delle caratteristiche microgliali.
A differenza dei metodi iPSC, le cellule iMG non richiedono alcuna modificazione genetica e possono essere generate in brevissimo tempo mediante semplice induzione chimica, con conseguente riduzione dei tempi e dei costi finanziari. Inoltre, le cellule iMG non richiedono la riprogrammazione genetica, quindi riteniamo che le cellule iMG siano potenti cellule surrogate per valutare non solo i tratti ma anche gli stati della microglia umana. Nell’articolo iniziale sulla tecnica iMG nel 2014, abbiamo confermato che le cellule iMG mostrano un fenotipo di microglia umana, che può essere distinto dai monociti e dai macrofagi. Ad esempio, le cellule iMG hanno mostrato un rapporto di sovraespressione del recettore delle chemochine CX3C 1 (CX3CR1) e del recettore delle chemochine C-C di tipo 2 (CCR2) rispetto ai monociti e ai tipici marcatori della microglia, tra cui la proteina transmembrana 119 (TMEM 119) e il recettore purinergico P2RY12 5,17. Recentemente, abbiamo convalidato che le cellule iMG derivate dal sangue periferico assomigliano alla microglia cerebrale nel loro profilo di espressione genica di marcatori microgliali ben noti nello stesso paziente che ha subito interventi chirurgici al cervello18. Le cellule iMG possono essere analizzate per funzioni dinamiche a livello molecolare, come la fagocitosi e la produzione di citochine, e si prevede che compensino gli svantaggi della ricerca cerebrale post-mortem e degli studi PET.
Abbiamo scoperto meccanismi fisiopatologici dinamici precedentemente sconosciuti che coinvolgono la microglia in pazienti con diagnosi di malattia di Nasu-Hakola5, fibromialgia19, disturbo bipolare20,21 o malattia di Moyamoya22. Inoltre, sulla base della nostra metodologia originale, vari laboratori hanno impiegato le cellule iMG (alcuni laboratori hanno designato nomi alternativi a queste cellule) come strumento cruciale di ricerca traslazionale inversa 23,24,25,26,27. Sellgren et al. hanno generato con successo cellule iMG in conformità con le nostre raccomandazioni e hanno condotto un’analisi di microarray, che ha rivelato che queste cellule assomigliano molto alla microglia cerebrale umana23. Recentemente, abbiamo confermato la somiglianza tra le cellule iMG umane e la microglia primaria cerebrale utilizzando il sequenziamento dell’RNA18.
Questo studio mirava a documentare la metodologia per generare cellule iMG dal sangue periferico umano per facilitare la ricerca traslazionale inversa incentrata sulle malattie neuropsichiatriche. Questa tecnica presenta il potenziale come uno strumento analitico ragionevole in grado di produrre senza sforzo modelli cellulari microgliali in un breve periodo, anche in laboratori mal attrezzati che mancano di apparecchiature di trasferimento genico o personale competente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le tecniche analitiche che impiegano cellule iMG possono fungere da potenti strumenti di ricerca traslazionale inversa 5,6. Per generare quantità sufficienti di cellule iMG umane, gli sperimentatori dovrebbero progettare i loro studi prendendo in considerazione alcuni aspetti. I campioni di sangue derivati da esseri umani sono estremamente sensibili; Di conseguenza, i campioni ottenuti garantiscono una pronta elaborazione e una manipolazione meticolosa per evita…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dalle seguenti sovvenzioni per la ricerca scientifica: (1) La Società giapponese per la promozione della scienza (KAKENHI; JP18H04042, JP19K21591, JP20H01773 e JP22H00494 a TAK, JP22H03000 a M.O.); (2) L’Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (AMED; JP21wm0425010 a TAK, JP22dk0207065 a M.O.) e (3) l’Agenzia giapponese per la scienza e la tecnologia CREST (da JPMJCR22N5 a TAK). Gli enti finanziatori non hanno assunto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto. Ringraziamo Editage (www.editage.jp) per l’editing in lingua inglese.
Materials
| 0.1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 30-5140-5 | |
| 4% paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 09154-14 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | gibco | 15240-062 | described as "antibiotic-antimycotic solution" |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer" |
| CD11b MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130–049-601 | |
| DAPI solution | DOJINDO | 28718-90-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Nacalai Tesque | 14249-24 | described as "PBS (−)" |
| Fetal Bovine Serum | biowest | S1760-500 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | described as "density gradient medium" |
| Human FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130–059-901 | |
| Leucosep | Greiner Bio-One | 227290 | described as "density gradient centrifugation tube" |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | described as "magnetic column" |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution" |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | described as "magnetic stand" |
| Penicillin-Streptomycin | Nacalai Tesque | 26253–84 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | described as "mounting media" |
| recombinant human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM | |
| recombinant human IL-34 | R&D Systems | 5265-IL | |
| RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium) | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | described as "basal induction medium" |
| RPMI-1640 | Nacalai Tesque | 30264-56 | |
| Antibodies | |||
| anti-P2RY12 antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | primary antibody, rabbit, 1:100 |
| anti-TMEM119 antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | primary antibody, rabbit, 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | invitrogen | A-11011 | secondary antibody, rabbit, 1:1000 |
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