Engineering van door menselijk bloed geïnduceerde microglia-achtige cellen voor omgekeerd translationeel hersenonderzoek
Summary
Deze studie schetst een nieuwe benadering voor de oprichting van menselijke monocyt-afgeleide microglia-achtige (iMG) cellen die de indirecte beoordeling van hersenontsteking mogelijk maken. Dit presenteert een cellulair model dat nuttig kan zijn voor onderzoek dat zich richt op mogelijke ontsteking van de hersenen en bijbehorende neuropsychiatrische stoornissen.
Abstract
Recente onderzoeken met diermodellen hebben het belang van microglia als cruciale immunologische modulatoren bij verschillende neuropsychiatrische en fysieke ziekten benadrukt. Postmortale hersenanalyse en beeldvorming met positronemissietomografie zijn representatieve onderzoeksmethoden die microgliale activering bij menselijke patiënten evalueren; De bevindingen hebben de activering van microglia in de hersenen van patiënten met verschillende neuropsychiatrische stoornissen en chronische pijn aan het licht gebracht. Desalniettemin vergemakkelijkt de bovengenoemde techniek slechts de beoordeling van beperkte aspecten van microgliale activering.
In plaats van hersenbiopsie en de geïnduceerde pluripotente stamceltechniek, bedachten we in eerste instantie een techniek om direct geïnduceerde microglia-achtige (iMG) cellen te genereren uit vers afgeleide menselijke perifere bloedmonocyten door ze gedurende 2 weken aan te vullen met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor en interleukine 34. Deze iMG-cellen kunnen worden gebruikt om dynamische morfologische en moleculaire analyses uit te voeren met betrekking tot fagocytische capaciteit en cytokine-afgifte na stressstimulatie op cellulair niveau. Onlangs is uitgebreide transcriptoomanalyse gebruikt om de gelijkenis tussen menselijke iMG-cellen en primaire microglia in de hersenen te verifiëren.
De van de patiënt afgeleide iMG-cellen kunnen dienen als belangrijke surrogaatmarkers voor het voorspellen van microgliale activering in menselijke hersenen en hebben geholpen bij de onthulling van voorheen onbekende dynamische pathofysiologie van microglia bij patiënten met de ziekte van Nasu-Hakola, fibromyalgie, bipolaire stoornis en de ziekte van Moyamoya. Daarom dient de op iMG gebaseerde techniek als een waardevol omgekeerd translationeel hulpmiddel en biedt het nieuwe inzichten in het ophelderen van de moleculaire pathofysiologie van microglia bij een verscheidenheid aan mentale en fysieke ziekten.
Introduction
In de afgelopen jaren is gesuggereerd dat hersenontsteking een cruciale rol speelt in de pathofysiologie van verschillende hersen- en neuropsychiatrische stoornissen; de microglia zijn gemarkeerd als belangrijke immunomodulerende cellen door menselijke postmortale hersenanalyse en op positronemissietomografie (PET) gebaseerde biobeeldvormingstechnieken 1,2,3,4. Postmortale hersen- en PET-beeldvormingsanalyses onthullen significante bevindingen; Desalniettemin zijn deze benaderingen echter inefficiënt in termen van het vastleggen van de dynamische moleculaire activiteiten van menselijke microglia in de hersenen in hun geheel. Daarom zijn nieuwe strategieën nodig om de uitgebreide evaluatie van menselijke microgliale functies en disfuncties op moleculair en cellulair niveau mogelijk te maken.
In 2014 ontwikkelden we oorspronkelijk een nieuwe techniek om direct geïnduceerde microglia-achtige (iMG) cellen 5,6 te produceren, voorafgaand aan de eerste publicatie van van mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide microglia-achtige cellen in 20167. In slechts 2 weken hebben we met succes menselijke perifere bloedmonocyten omgezet in iMG-cellen door de cytokines, granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) en interleukine 34 (IL-34) te optimaliseren. Toen we deze techniek ontwikkelden, begon de innovatieve herprogrammeringsmethode om neuronale cellen te induceren uit iPS-cellen of fibroblasten net de overhand te krijgen in de wereld 8,9,10,11. Op dat moment was er echter nog geen methode gerapporteerd voor het induceren van iPS-afgeleide microgliacellen en was het genereren van een menselijk somatisch cel-afgeleid microgliamodel gewenst. Aangezien cytokinen zoals GM-CSF en IL-34, macrofaagkoloniestimulerende factor, noodzakelijk werden geacht voor de ontwikkeling en het onderhoud van microglia 12,13,14,15, veronderstelden we dat een combinatie van deze cytokinen direct zou kunnen worden toegepast om een microgliaal cellulair model te genereren uit bloedmonocyten. Ten slotte zijn we erin geslaagd om een model van microglia afgeleid van monocyten te ontwikkelen door GM-CSF en IL-345 te combineren. Bovendien worden sommige van deze combinaties van cytokinen ook gebruikt om microglia uit iPS-cellente induceren 7,16 en wordt aangenomen dat ze een belangrijke factor zijn bij het verkrijgen van microgliale kenmerken.
In tegenstelling tot iPSC-methoden vereisen iMG-cellen geen genetische modificatie en kunnen ze in zeer korte tijd worden gegenereerd door eenvoudige chemische inductie, wat resulteert in lagere tijd- en financiële kosten. Bovendien vereisen iMG-cellen geen genetische herprogrammering, dus we zijn van mening dat iMG-cellen krachtige surrogaatcellen zijn om niet alleen de eigenschappen, maar ook de toestanden van menselijke microglia te evalueren. In het eerste artikel over de iMG-techniek in 2014 bevestigden we dat iMG-cellen een fenotype van menselijke microglia vertonen, dat kan verschillen van monocyten en macrofagen. iMG-cellen vertoonden bijvoorbeeld een overexpressieverhouding van CX3C-chemokinereceptor 1 (CX3CR1) en C-C-chemokinereceptor type 2 (CCR2) dan monocyten en typische microglia-markers, waaronder transmembraaneiwit 119 (TMEM 119) en purinerge receptor P2RY12 5,17. Onlangs hebben we gevalideerd dat perifere bloed-afgeleide iMG-cellen lijken op hersenmicroglia in hun genexpressieprofiel van bekende microgliale markers bij dezelfde patiënt die hersenoperaties onderging18. De iMG-cellen kunnen worden geanalyseerd op dynamische functies op moleculair niveau, zoals fagocytose en cytokineproductie, en zullen naar verwachting de nadelen van postmortaal hersenonderzoek en PET-onderzoeken compenseren.
We hebben voorheen onbekende dynamische pathofysiologische mechanismen ontdekt waarbij microglia betrokken zijn bij patiënten met de diagnose Nasu-Hakola-ziekte5, fibromyalgie19, bipolaire stoornis20,21 of de ziekte van Moyamoya22. Bovendien hebben verschillende laboratoria, op basis van onze oorspronkelijke methodologie, de iMG-cellen gebruikt (bepaalde laboratoria hebben alternatieve namen voor deze cellen aangewezen) als een cruciaal reverse-translationeel onderzoeksinstrument 23,24,25,26,27. Sellgren et al. genereerden met succes iMG-cellen in overeenstemming met onze aanbevelingen en voerden een microarray-analyse uit, waaruit bleek dat deze cellen sterk lijken op microglia van de menselijke hersenen23. Onlangs hebben we de gelijkenis tussen menselijke iMG-cellen en primaire microglia in de hersenen bevestigd met behulp van RNA-sequencing18.
Deze studie had tot doel de methodologie te documenteren om iMG-cellen te genereren uit menselijk perifeer bloed om omgekeerd translationeel onderzoek gericht op neuropsychiatrische ziekten te vergemakkelijken. Deze techniek biedt potentieel als een redelijk analytisch hulpmiddel dat moeiteloos microgliale cellulaire modellen in korte tijd kan produceren, zelfs in slecht uitgeruste laboratoria die geen apparatuur voor genoverdracht of bekwaam personeel hebben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analytische technieken waarbij gebruik wordt gemaakt van iMG-cellen kunnen dienen als krachtige reverse-translationele onderzoeksinstrumenten 5,6. Om voldoende hoeveelheden menselijke iMG-cellen te genereren, moeten onderzoekers bij het ontwerpen van hun studies rekening houden met bepaalde kwesties. Bloedmonsters afkomstig van mensen zijn extreem gevoelig; Bijgevolg garanderen de verkregen monsters een snelle verwerking en een nauwgezette behandeling om besmetti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de volgende subsidies voor wetenschappelijk onderzoek: (1) De Japanse Vereniging voor de Bevordering van de Wetenschap (KAKENHI; JP18H04042, JP19K21591, JP20H01773 en JP22H00494 aan TAK, JP22H03000 aan M.O.); (2) Het Japanse Agentschap voor Medisch Onderzoek en Ontwikkeling (AMED; JP21wm0425010 naar TAK, JP22dk0207065 naar M.O.) en (3) Het Japanse Agentschap voor Wetenschap en Technologie CREST (JPMJCR22N5 aan TAK). De financieringsinstanties namen geen rol op zich bij de opzet van het onderzoek, de gegevensverzameling en -analyse, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript. We willen Editage (www.editage.jp) bedanken voor de Engelse taalbewerking.
Materials
| 0.1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 30-5140-5 | |
| 4% paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 09154-14 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | gibco | 15240-062 | described as "antibiotic-antimycotic solution" |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer" |
| CD11b MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130–049-601 | |
| DAPI solution | DOJINDO | 28718-90-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Nacalai Tesque | 14249-24 | described as "PBS (−)" |
| Fetal Bovine Serum | biowest | S1760-500 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | described as "density gradient medium" |
| Human FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130–059-901 | |
| Leucosep | Greiner Bio-One | 227290 | described as "density gradient centrifugation tube" |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | described as "magnetic column" |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution" |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | described as "magnetic stand" |
| Penicillin-Streptomycin | Nacalai Tesque | 26253–84 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | described as "mounting media" |
| recombinant human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM | |
| recombinant human IL-34 | R&D Systems | 5265-IL | |
| RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium) | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | described as "basal induction medium" |
| RPMI-1640 | Nacalai Tesque | 30264-56 | |
| Antibodies | |||
| anti-P2RY12 antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | primary antibody, rabbit, 1:100 |
| anti-TMEM119 antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | primary antibody, rabbit, 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | invitrogen | A-11011 | secondary antibody, rabbit, 1:1000 |
References
- Steiner, J., et al. Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide. J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).
- Setiawan, E., et al. Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study. Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).
- Holmes, S. E., et al. Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study. Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).
- Meyer, J. H., et al. Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets. Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).
- Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Sci Rep. 4, 4957 (2014).
- Kato, T. A., Ohgidani, M., Kanba, S. Method of producing microglial cells. France patent EP. , (2023).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Mattis, V. B., Svendsen, C. N. Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology. Lancet Neurol. 10 (4), 383-394 (2011).
- Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10343-10348 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nat Immunol. 13 (8), 753-760 (2012).
- Aloisi, F., De Simone, R., Columba-Cabezas, S., Penna, G., Adorini, L. Functional maturation of adult mouse resting microglia into an APC is promoted by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interaction with Th1 cells. J Immunol. 164 (4), 1705-1712 (2000).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6 (10), e26317 (2011).
- Nandi, S., et al. The CSF-1 receptor ligands IL-34 and CSF-1 exhibit distinct developmental brain expression patterns and regulate neural progenitor cell maintenance and maturation. Dev Biol. 367 (2), 100-113 (2012).
- Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Rep. 8 (6), 1516-1524 (2017).
- Yonemoto, K., et al. Heterogeneity and mitochondrial vulnerability configurate the divergent immunoreactivity of human induced microglia-like cells. Clin Immunol. 255, 109756 (2023).
- Tanaka, S., et al. CD206 expression in induced microglia-like cells from peripheral blood as a surrogate biomarker for the specific immune microenvironment of neurosurgical diseases including glioma. Front Immunol. 12, 2424-2424 (2021).
- Ohgidani, M., et al. Fibromyalgia and microglial TNF-alpha: Translational research using human blood induced microglia-like cells. Sci Rep. 7 (1), 11882 (2017).
- Ohgidani, M., et al. Microglial CD206 gene has potential as a state marker of bipolar disorder. Front Immunol. 7, 676 (2016).
- Ohgidani, M., et al. A case of bipolar disorder with AIF1 (coding gene of Iba-1) deletion: A pilot in vitro analysis using blood-derived microglia-like cells. Psychiatry Clin Neurosci. 77 (2), 128-130 (2023).
- Shirozu, N., et al. Angiogenic and inflammatory responses in human induced microglia-like (iMG) cells from patients with Moyamoya disease. Sci Rep. 13 (1), 14842 (2023).
- Sellgren, C. M., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Mol Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Sellgren, C. M., et al. Increased synapse elimination by microglia in schizophrenia patient-derived models of synaptic pruning. Nat Neurosci. 22 (3), 374-385 (2019).
- Banerjee, A., et al. Validation of induced microglia-like cells (iMG Cells) for future studies of brain diseases. Front Cell Neurosci. 15, 629279 (2021).
- You, M. J., et al. A molecular characterization and clinical relevance of microglia-like cells derived from patients with panic disorder. Transl Psychiatry. 13 (1), 48 (2023).
- Rocha, N. P., et al. Microglia activation in basal ganglia is a late event in Huntington disease pathophysiology. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 8 (3), e984 (2021).
- Sargeant, T. J., Fourrier, C. Human monocyte-derived microglia-like cell models: A review of the benefits, limitations and recommendations. Brain Behav Immun. 107, 98-109 (2023).
- Lannes, N., et al. Interactions of human microglia cells with Japanese encephalitis virus. Virol J. 14 (1), 8 (2017).
- Ryan, K. J., et al. A human microglia-like cellular model for assessing the effects of neurodegenerative disease gene variants. Sci Transl Med. 9 (421), 7635 (2017).
- Etemad, S., Zamin, R. M., Ruitenberg, M. J., Filgueira, L. A novel in vitro human microglia model: characterization of human monocyte-derived microglia. J Neurosci Methods. 209 (1), 79-89 (2012).
- Bortolotti, D., Gentili, V., Rotola, A., Caselli, E., Rizzo, R. HHV-6A infection induces amyloid-beta expression and activation of microglial cells. Alzheimers Res Ther. 11 (1), 104 (2019).
- Ormel, P. R., et al. A characterization of the molecular phenotype and inflammatory response of schizophrenia patient-derived microglia-like cells. Brain Behav Immun. 90, 196-207 (2020).
- Akiyama, H., et al. Expression of HIV-1 intron-containing RNA in microglia induces inflammatory responses. J Virol. 95 (5), e01386-e01420 (2021).
- Nielsen, M. C., Andersen, M. N., Moller, H. J. Monocyte isolation techniques significantly impact the phenotype of both isolated monocytes and derived macrophages in vitro. Immunology. 159 (1), 63-74 (2020).
- Kelly, A., Grabiec, A. M., Travis, M. A. Culture of human monocyte-derived macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 1-11 (2018).
