هندسة الخلايا الدبقية الصغيرة المستحثة بالدم البشري لأبحاث الدماغ العكسية
Summary
تحدد هذه الدراسة نهجا جديدا لإنشاء خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية (iMG) والتي تمكن من التقييم غير المباشر لالتهاب الدماغ. يقدم هذا نموذجا خلويا قد يكون مفيدا للبحث الذي يركز على الالتهاب المحتمل للدماغ والاضطرابات العصبية والنفسية المرتبطة به.
Abstract
أبرزت التحقيقات الحديثة التي تستخدم النماذج الحيوانية أهمية الخلايا الدبقية الصغيرة كمعدلات مناعية حاسمة في مختلف الأمراض العصبية والنفسية والجسدية. تحليل الدماغ بعد الوفاة والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني هي طرق بحث تمثيلية تقيم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في المرضى من البشر. كشفت النتائج عن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في أدمغة المرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية نفسية مختلفة وألم مزمن. ومع ذلك ، فإن التقنية المذكورة أعلاه تسهل فقط تقييم الجوانب المحدودة لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة.
بدلا من خزعة الدماغ وتقنية الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، ابتكرنا في البداية تقنية لتوليد خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة (iMG) المستحثة مباشرة من وحيدات الدم المحيطية البشرية المشتقة حديثا عن طريق استكمالها بعامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم والإنترلوكين 34 لمدة 2 أسابيع. يمكن استخدام خلايا iMG هذه لإجراء تحليلات مورفولوجية وجزيئية ديناميكية تتعلق بقدرة البلعمة وإطلاق السيتوكين بعد تحفيز الإجهاد على المستوى الخلوي. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام تحليل شامل للنسخ للتحقق من التشابه بين خلايا iMG البشرية والخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في الدماغ.
قد تكون خلايا iMG المشتقة من المريض بمثابة علامات بديلة رئيسية للتنبؤ بالتنشيط الدبقي الصغير في أدمغة البشر وقد ساعدت في الكشف عن الفيزيولوجيا المرضية الديناميكية غير المعروفة سابقا للخلايا الدبقية الصغيرة في المرضى الذين يعانون من مرض ناسو هاكولا ، والألم العضلي الليفي ، والاضطراب ثنائي القطب ، ومرض مويامويا. لذلك ، تعمل التقنية القائمة على iMG كأداة قيمة للترجمة العكسية وتوفر رؤى جديدة في توضيح ديناميكية الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة في مجموعة متنوعة من الأمراض العقلية والجسدية.
Introduction
في السنوات الأخيرة ، اقترح أن يؤدي التهاب الدماغ أدوارا محورية في الفيزيولوجيا المرضية لمختلف اضطرابات الدماغ والاضطرابات العصبية والنفسية. تم تسليط الضوء على الخلايا الدبقية الصغيرة كخلايا مناعية رئيسية من خلال تحليل الدماغ البشري بعد الوفاة وتقنيات التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET)1،2،3،4. تكشف تحليلات تصوير الدماغ والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني بعد الوفاة عن نتائج مهمة. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب غير فعالة من حيث التقاط الأنشطة الجزيئية الديناميكية للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في الدماغ بالكامل. لذلك ، هناك حاجة إلى استراتيجيات جديدة لتمكين التقييم الشامل لوظائف الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية والاختلالات الوظيفية على المستويين الجزيئي والخلوي.
في عام 2014 ، قمنا في الأصل بتصميم تقنية جديدة لإنتاج خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة (iMG) المستحثة مباشرة 5,6 ، قبل النشر الأول للخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (iPSC) الشبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الإنسان في عام 20167. في أسابيع 2 فقط ، نجحنا في تحويل وحيدات الدم المحيطية البشرية إلى خلايا iMG عن طريق تحسين السيتوكينات ، عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) والإنترلوكين 34 (IL-34). عندما طورنا هذه التقنية ، كانت طريقة إعادة البرمجة المبتكرة لتحفيز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو الخلايا الليفية قد بدأت للتو في الانتشار فيالعالم 8،9،10،11. ومع ذلك ، في ذلك الوقت ، لم يتم الإبلاغ عن طريقة لتحفيز الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPS ، وكان من المرغوب فيه إنشاء نموذج الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجسدية البشرية. نظرا لأن السيتوكينات مثل GM-CSF و IL-34 ، عامل تحفيز مستعمرة البلاعم ، تم الإبلاغ عن أنها ضرورية لتطوير وصيانة الخلايا الدبقية الصغيرة12،13،14،15 ، افترضنا أنه يمكن تطبيق مزيج من هذه السيتوكينات مباشرة لتوليد نموذج خلوي دبقي صغير من وحيدات الدم. أخيرا ، نجحنا في تطوير نموذج للخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الوحيدة من خلال الجمع بين GM-CSF و IL-345. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام بعض هذه المجموعات من السيتوكينات أيضا للحث على الخلايا الدبقية الصغيرة من خلايا iPS 7,16 ويفترض أنها عامل مهم في اكتساب خصائص الخلايا الدبقية الصغيرة.
على عكس طرق iPSC ، لا تتطلب خلايا iMG أي تعديل وراثي ويمكن توليدها في وقت قصير جدا عن طريق الحث الكيميائي البسيط ، مما يؤدي إلى انخفاض الوقت والتكاليف المالية. علاوة على ذلك ، لا تتطلب خلايا iMG إعادة برمجة جينية ، لذلك نعتقد أن خلايا iMG هي خلايا بديلة قوية لتقييم ليس فقط السمات ولكن أيضا حالات الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية. في الورقة الأولية حول تقنية iMG في عام 2014 ، أكدنا أن خلايا iMG تظهر نمطا ظاهريا من الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية ، والتي يمكن أن تكون متميزة عن الخلايا الوحيدة والبلاعم. على سبيل المثال ، أظهرت خلايا iMG نسبة تعبير مفرطة لمستقبلات CX3C chemokine 1 (CX3CR1) ومستقبلات C-C chemokine من النوع 2 (CCR2) من الخلايا الوحيدة وعلامات الخلايا الدبقية الصغيرة النموذجية ، بما في ذلك البروتين عبر الغشاء 119 (TMEM 119) ومستقبلات البيورينرجيك P2RY12 5,17. في الآونة الأخيرة ، تحققنا من أن خلايا iMG المشتقة من الدم المحيطي تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ في ملف تعريف التعبير الجيني لعلامات الخلايا الدبقية الصغيرة المعروفة في نفس المريض الذي خضع لجراحات الدماغ18. يمكن تحليل خلايا iMG للوظائف الديناميكية على المستوى الجزيئي ، مثل البلعمة وإنتاج السيتوكين ، ومن المتوقع أن تعوض عن عيوب أبحاث الدماغ بعد الوفاة ودراسات التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني.
لقد اكتشفنا آليات فيزيولوجية مرضية ديناميكية غير معروفة سابقا تتضمن الخلايا الدبقية الصغيرة في المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بمرض ناسو هاكولا5 أو الألم العضليالليفي 19 أو الاضطراب ثنائي القطب20,21 أو مرض مويامويا22. علاوة على ذلك ، بناء على منهجيتنا الأصلية ، استخدمت مختبرات مختلفة خلايا iMG (حددت بعض المختبرات أسماء بديلة لهذه الخلايا) كأداة بحث عكسية حاسمة23،24،25،26،27. نجح Sellgren et al. في إنشاء خلايا iMG وفقا لتوصياتنا وأجرى تحليلا دقيقا ، والذي كشف أن هذه الخلايا تشبه إلى حد كبير الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ البشري23. في الآونة الأخيرة ، أكدنا التشابه بين خلايا iMG البشرية والخلايا الدبقية الأولية في الدماغ باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي18.
تهدف هذه الدراسة إلى توثيق منهجية توليد خلايا iMG من الدم المحيطي البشري لتسهيل الأبحاث العكسية التي تركز على الأمراض العصبية والنفسية. تقدم هذه التقنية إمكانات كأداة تحليلية معقولة يمكنها إنتاج نماذج خلوية دبقية صغيرة دون عناء في فترة وجيزة ، حتى في المختبرات غير المجهزة التي تفتقر إلى أجهزة نقل الجينات أو الموظفين الأكفاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
قد تكون التقنيات التحليلية التي تستخدم خلايا iMG بمثابة أدوات بحث عكسية قوية 5,6. لتوليد كميات كافية من خلايا iMG البشرية ، يجب على المجربين تصميم دراساتهم مع مراعاة بعض القضايا. عينات الدم المستمدة من البشر حساسة للغاية. وبالتالي ، فإن العينات التي تم الحصول عل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا العمل بدعم جزئي من المنح المساعدة التالية للبحث العلمي: (1) الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (KAKENHI; JP18H04042 و JP19K21591 و JP20H01773 و JP22H00494 إلى TAK ، JP22H03000 إلى M.O.) ؛ (2) الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (AMED; JP21wm0425010 إلى TAK ، JP22dk0207065 إلى M.O.) و (3) وكالة العلوم والتكنولوجيا اليابانية CREST (JPMJCR22N5 إلى TAK). لم تضطلع هيئات التمويل بأي أدوار في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطات. نود أن نشكر Editage (www.editage.jp) على تحرير اللغة الإنجليزية.
Materials
| 0.1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 30-5140-5 | |
| 4% paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 09154-14 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | gibco | 15240-062 | described as "antibiotic-antimycotic solution" |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer" |
| CD11b MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130–049-601 | |
| DAPI solution | DOJINDO | 28718-90-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Nacalai Tesque | 14249-24 | described as "PBS (−)" |
| Fetal Bovine Serum | biowest | S1760-500 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | described as "density gradient medium" |
| Human FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130–059-901 | |
| Leucosep | Greiner Bio-One | 227290 | described as "density gradient centrifugation tube" |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | described as "magnetic column" |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution" |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | described as "magnetic stand" |
| Penicillin-Streptomycin | Nacalai Tesque | 26253–84 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | described as "mounting media" |
| recombinant human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM | |
| recombinant human IL-34 | R&D Systems | 5265-IL | |
| RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium) | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | described as "basal induction medium" |
| RPMI-1640 | Nacalai Tesque | 30264-56 | |
| Antibodies | |||
| anti-P2RY12 antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | primary antibody, rabbit, 1:100 |
| anti-TMEM119 antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | primary antibody, rabbit, 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | invitrogen | A-11011 | secondary antibody, rabbit, 1:1000 |
References
- Steiner, J., et al. Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide. J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).
- Setiawan, E., et al. Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study. Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).
- Holmes, S. E., et al. Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study. Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).
- Meyer, J. H., et al. Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets. Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).
- Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Sci Rep. 4, 4957 (2014).
- Kato, T. A., Ohgidani, M., Kanba, S. Method of producing microglial cells. France patent EP. , (2023).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Mattis, V. B., Svendsen, C. N. Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology. Lancet Neurol. 10 (4), 383-394 (2011).
- Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10343-10348 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nat Immunol. 13 (8), 753-760 (2012).
- Aloisi, F., De Simone, R., Columba-Cabezas, S., Penna, G., Adorini, L. Functional maturation of adult mouse resting microglia into an APC is promoted by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interaction with Th1 cells. J Immunol. 164 (4), 1705-1712 (2000).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6 (10), e26317 (2011).
- Nandi, S., et al. The CSF-1 receptor ligands IL-34 and CSF-1 exhibit distinct developmental brain expression patterns and regulate neural progenitor cell maintenance and maturation. Dev Biol. 367 (2), 100-113 (2012).
- Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Rep. 8 (6), 1516-1524 (2017).
- Yonemoto, K., et al. Heterogeneity and mitochondrial vulnerability configurate the divergent immunoreactivity of human induced microglia-like cells. Clin Immunol. 255, 109756 (2023).
- Tanaka, S., et al. CD206 expression in induced microglia-like cells from peripheral blood as a surrogate biomarker for the specific immune microenvironment of neurosurgical diseases including glioma. Front Immunol. 12, 2424-2424 (2021).
- Ohgidani, M., et al. Fibromyalgia and microglial TNF-alpha: Translational research using human blood induced microglia-like cells. Sci Rep. 7 (1), 11882 (2017).
- Ohgidani, M., et al. Microglial CD206 gene has potential as a state marker of bipolar disorder. Front Immunol. 7, 676 (2016).
- Ohgidani, M., et al. A case of bipolar disorder with AIF1 (coding gene of Iba-1) deletion: A pilot in vitro analysis using blood-derived microglia-like cells. Psychiatry Clin Neurosci. 77 (2), 128-130 (2023).
- Shirozu, N., et al. Angiogenic and inflammatory responses in human induced microglia-like (iMG) cells from patients with Moyamoya disease. Sci Rep. 13 (1), 14842 (2023).
- Sellgren, C. M., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Mol Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Sellgren, C. M., et al. Increased synapse elimination by microglia in schizophrenia patient-derived models of synaptic pruning. Nat Neurosci. 22 (3), 374-385 (2019).
- Banerjee, A., et al. Validation of induced microglia-like cells (iMG Cells) for future studies of brain diseases. Front Cell Neurosci. 15, 629279 (2021).
- You, M. J., et al. A molecular characterization and clinical relevance of microglia-like cells derived from patients with panic disorder. Transl Psychiatry. 13 (1), 48 (2023).
- Rocha, N. P., et al. Microglia activation in basal ganglia is a late event in Huntington disease pathophysiology. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 8 (3), e984 (2021).
- Sargeant, T. J., Fourrier, C. Human monocyte-derived microglia-like cell models: A review of the benefits, limitations and recommendations. Brain Behav Immun. 107, 98-109 (2023).
- Lannes, N., et al. Interactions of human microglia cells with Japanese encephalitis virus. Virol J. 14 (1), 8 (2017).
- Ryan, K. J., et al. A human microglia-like cellular model for assessing the effects of neurodegenerative disease gene variants. Sci Transl Med. 9 (421), 7635 (2017).
- Etemad, S., Zamin, R. M., Ruitenberg, M. J., Filgueira, L. A novel in vitro human microglia model: characterization of human monocyte-derived microglia. J Neurosci Methods. 209 (1), 79-89 (2012).
- Bortolotti, D., Gentili, V., Rotola, A., Caselli, E., Rizzo, R. HHV-6A infection induces amyloid-beta expression and activation of microglial cells. Alzheimers Res Ther. 11 (1), 104 (2019).
- Ormel, P. R., et al. A characterization of the molecular phenotype and inflammatory response of schizophrenia patient-derived microglia-like cells. Brain Behav Immun. 90, 196-207 (2020).
- Akiyama, H., et al. Expression of HIV-1 intron-containing RNA in microglia induces inflammatory responses. J Virol. 95 (5), e01386-e01420 (2021).
- Nielsen, M. C., Andersen, M. N., Moller, H. J. Monocyte isolation techniques significantly impact the phenotype of both isolated monocytes and derived macrophages in vitro. Immunology. 159 (1), 63-74 (2020).
- Kelly, A., Grabiec, A. M., Travis, M. A. Culture of human monocyte-derived macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 1-11 (2018).
