Kemirgen Kardiyak Greftlerin Daha Uzun Perfüzyon Süreleri için Modifiye Langendorff Perfüzyonu

Bu çalışma, Massachusetts General Hospital Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından yürütülmüştür. 1. Sistem tasarımı Sistemi, bir kabarcık kapanı, bir rezervuar, bir oksijenatör, bir peristaltik pompa ve bir su sirkülatörü dahil olmak üzere üç çift ceketli bileşenle birleştirin. Tüm ceketli bileşenleri tek bir kelepçe standına takın. Bileşenleri silikon boru ile iki farklı sırayla sırayla bağlayın (Şekil 1A).Sıra 1 – Ceket boyunca suyun akış modeli ( Şekil 1A’daki düz çizgiler):Su sirkülatörünün çıkışını 36 G boru kullanarak kabarcık tutucu ceketinin alt girişine bağlayın. Bu, perfüzatın kalbe ulaşmadan önce uygun sıcaklıkta (37 °C) tutulmasını garanti edecektir, çünkü su sistemin diğer bileşenlerinden geçerken ısı kaybedecektir. Kabarcık kapanı ceketinin üst girişini, aynı boyutta boru kullanarak rezervuar ceketinin alt girişine bağlayın. Ardından, rezervuar ceketinin üst girişini oksijenatör ceketinin alt girişine bağlayın. Son olarak, oksijenatörün üst girişini su sirkülatörünün girişine bağlayın. Sıra 2 – Perfüzatın sistem boyunca akış modeli ( Şekil 1A’da kesikli çizgiler)Luer konektörlerini 16 G borunun her iki tarafına takın. İlk ucunu rezervuarın tabanına takın ve peristaltik pompa kafasından geçirin. Diğer ucunu oksijenatör içindeki silikon bobinin girişlerinden birine bağlayın. Oksijenatörün silikon bobininin ikinci girişinde, her iki ucunda luer kilit konektörleri bulunan ikinci bir 16 G boru parçasını, uzun çıkıntılı kabarcık kapanındaki girişe bağlayın. Luer konektörlerle donatılmış daha kısa bir 16 G boru parçasını, kabarcık kapanının kullanılmayan çıkışına üç bir luer kilit valfine bağlayın. Üç vananın karşı tarafında, bir parça 16 G boruyu diğer ucunda ikinci bir luer vana ile bağlayın. Bu ikinci valf, rezervuarın hemen üzerinde yer almaktadır. Valfin karşı tarafını daha fazla 16 G boruya ve ardından basınç sensörüne bağlayın. Daha küçük çaplı bir boruyu ( ̃3.7 mm) kanüle (14 G anjiyokat) bir konektörle üç vananın dikey portuna bağlayın. Perfüzat, aort kanül bağlantısı yoluyla rezervuara geri dönmeden önce rezervuardan kabarcık tuzağı yoluyla oksijenatöre akar. 2. Perfüzat hazırlama Baz perfüzat, %0.96 Krebs-Henseleit Tamponu, 9.915 mM Dekstran, 25 mM Sodyum Bikarbonat, 1.054 mM Sığır Serum Albümini, %1 Pen Strep, %0.13 İnsülin, %0.02 Hidrokortizon, %0.5 Heparin ve 2.75 mM Kalsiyum Klorür hazırlayın ve damıtılmış su ile hacim haline getirin. 3. Perfüzyon sistemi kurulumu İki adet 10 mL’lik şırıngayı kabarcık kapanındaki üst ve yan havalandırma portlarına bağlayın. Baz perfüzatı (75 mL) rezervuara ekleyin. Peristaltik pompayı açın ve su sirkülatörünü 37 °C’ye ayarlayın. Oksijenatördeki üçüncü girişe bir oksijen (O2 ve %5 CO2) hattı bağlayın ve perfüzatı minimum pO2 400 mmHg’ye kadar oksijenlendirin. Kabarcık kapanını hemen geçecek şekilde üç vananın dikey portuna bir enjeksiyon portu sabitleyin. 1 mL şırınga ile kanatlı bir infüzyon iğnesini enjeksiyon portuna bağlayın (örnekleme için kullanılır). Devreye giren kabarcıkları temizlemek için enjeksiyon portuna hafifçe vurun veya 1 mL şırınga ile perfüzat çekin. Baz perfüzat sıcaklık ve oksijen seviyesine ulaştığında, doğru iyon konsantrasyonunu (Tablo 1) ve uygun oksijenasyonu sağlamak için biyokimyasal parametrelerin ilk okumasını yapın.NOT: İyon ve pH seviyeleri, çözelti sıcaklığa getirildikten (37 °C) ve uygun gaz karışımı ( O2,% 5 CO2) ile oksijenlendikten sonra okunmalıdır. Bağlı tüpün kelepçesini açarak basınç sensörünü sıfırlayın ve perfüzatın açık sensörden ve kanülden akmasına izin verin. Dengelendikten sonra, sensör kutusundaki sıfır düğmesine basın ve boruyu yeniden sıkıştırın. 1 mL/dk ile 15 mL/dk arasında değişen akışlar için kalbin sisteme bağlanmasından önce baz basınçlarını kaydedin. Düşük basınçlı perfüzyonAdenozin damlası: Baz perfüzatta başlangıçta 20 mM’lik bir adenosin stoğu yapın. Tüpü ılık su banyosuna yerleştirerek ve ters çevirerek karıştırarak adenozini çözün. Stok adenozini, baz perfüzat içinde 0.06 mg / mL’lik bir konserasyona kadar seyreltin ve 50 mL’lik bir şırıngaya ekleyin. 50 mL şırıngaya kanatlı bir infüzyon iğnesi takın ve üç vanadaki enjeksiyon portuna bağlayın. Şırıngayı bir şırınga pompasına sabitleyin ve 166,6 μL/dk infüzyon hızına ayarlayın.NOT: Kabarcıklar, bağlantı noktasına hafifçe vurularak veya hafifçe vurularak infüzyon portundan serbest bırakılır. Yüksek basınçlı perfüzyon:Paketlenmiş kırmızı kan hücreleri (pRBC’ler) izolasyonu:Bir donör sıçanın kardiyak ponksiyonu yoluyla 10-12 mL tam sıçan kanı toplayın. Kanı 10 dakika boyunca 2000 x g’da santrifüj edin. Plazma ve buffy coat tabakasını pipetleme ile çıkarın. pRBC’leri kalsiyum klorür olmadan 1: 1 oranında (örneğin, 5 mL pRBC’ler: 5 mL perfüzat) perfüzat içinde yeniden süspanse ederek ters çevirme ile karıştırın. Toplam 3 yıkama için 3.8.1.2-3.8.1.4 adımlarını iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri perfüzat içinde 1:1 oranında yeniden süspanse edin ve karışımı, halihazırda 75 mL baz perfüzat içeren perfüzyon sistemine ekleyin. Hücrelerin sistem boyunca eşit olarak dağılmasına izin verin ve bir hematoloji makinesi kullanarak perfüzatın hematokritini ölçün. Hematokrit %5-%7 arasında değişir. 4. Kardiyak greft tedarik hazırlığı Soğuk iskemi süresini en aza indirmek için tedarike başlamadan önce perfüzyon sistemini tamamen hazırlayın. Cerrahi aletleri hazırlayın. Cerrahi aletler arasında mavi pedler, cerrahi bant, ipek 5-0 dikişler, pamuklu çubuklar, salin şırıngalar (50 mL ve 10 mL), ameliyat makasları, forsepsler, mikro makaslar, mikro forsepsler, Halstead kelepçesi, 30 U heparin, 16 G portal yıkama için boru, kalbin kanülasyonu için 14 G boru, 16 G anjiyokat, modifiye edilmiş 14 G anjiyokat, manşetli, basınç sensörü, buzlu buz kovası, 47 mm Petri kabı, gazlı bez. 14 G kanül üzerine ince bir boru halkası (iç çap [ID] 0.167 mm, dış çap [OD] 2.42 mm) yerleştirerek modifiye bir kanül oluşturun ve bir manşet etkisi yaratın.Kanülün iğnesini çıkarın ve halkanın altına bir damla süper yapıştırıcı ekleyin. Halkayı dikkatlice kanülün tabanının 1/4 inç yukarısına kaydırın. Kullanmadan önce tutkalın kurumasını bekleyin. Kanülü manşete mümkün olduğunca yakın bir açıyla kesin ve keskin kenarları çıkarın. Portal ven yıkaması için 60 mL’lik bir şırıngayı heparinize salin (0.03 U/mL) ile doldurun. Şırıngayı basınç sensörüne ve ardından 16 G yıkama borusuna bağlayın. 10 mL’lik bir heparinize salin şırıngasını (0.03 U / mL) 14 G tüpe bağlayın. Tüpün diğer ucunu aort kanülüne bağlayın ve hava kabarcıklarını gidermek için yıkayın. Aort kanülünü gazlı bez ile doldurulmuş ve tuzlu su ile doldurulmuş 47 mm’lik bir Petri kabına yerleştirin. Kalp perfüzyon sistemine bağlanana kadar petri kabını buz üzerinde bırakın. 5. Kardiyak greft alımı Sıçanları% 3 izofluran içeren bir anestezik odada uyuşturun. Refleksler fark edilmediğinde, fareyi odadan çıkarın, cerrahi boşluğa yerleştirin ve yüz maskesi aracılığıyla sürekli izofluran (% 3) verin. Ayak parmağı sıkıştırma testinden sonra, hayvanı 30 U heparin ile penis damarından heparinize edin. Fareyi tüm karın ve üst göğüs bölgesi boyunca tıraş edin. Kürk talaşını cerrahi alandan çıkarın. Ameliyat sırasında hareket etmediğinden emin olmak için her uzvu bantlayın. Alt karın derisinde yatay bir orta hat kesisi yapın ve karın kaslarını açığa çıkarın. Karın kaslarında iç organları açığa çıkaran ikinci bir yatay orta hat kesisi yapın. Sternumu ortaya çıkarın, bir hemostat ile sabitleyin ve karaciğeri ve portal veni ortaya çıkarmak için kraniyal olarak geri çekin. 16 gauge anjiyokatat kullanarak portal veni kanüle edin. 60 mL’lik heparinize salin şırıngasını anjiyokata takın ve havalandırma için inferior vena kava ve abdominal aortta bir insizyon oluşturun. Tam miktarda salini portal damardan boşaltın.NOT: Yıkama basıncı 10 mmHg civarında kalmalıdır. Diyaframda yatay bir kesim yapın, ardından göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için sternumun her iki tarafındaki kaburgalardan proksimal bir kesim yapın. Kalbi boşluktan çıkarın ve hemen buz üzerinde tuzlu su ile Petri kabına yerleştirin. Aort arkını tanımlayın, kanama durdurucularla klempleyin ve kalan bağ dokusunu temizleyerek inen aortu ortaya çıkarın. İnen aortun yarısına kadar yatay bir kesi yapın ve 14 G anjiyokata ile kanülasyon yapın.NOT: Kanül ile aort kapağını kırmayın. Kanülü manşetin üzerindeki bir dikişle sabitleyin ve kanama durdurucuyu serbest bırakın. Perfüzyon sistemine yerleştirilene kadar kalbin buz üzerinde kalmasına izin verin. 6. Perfüzyon başlangıcı Peristaltik pompanın akışını 1.0 mL/dk’ya ayarlayın.NOT: Aort kanülü, baloncukların koronerlere girmesini önlemek için her zaman kalbe göre 90°’lik bir açıyla tutulur (Şekil 1B). Kalbi sisteme takmadan önce kanül ile tartın.NOT: Aort kanülünde hava kabarcığı tamamen bulunmamalıdır. Kanülü sistemdeki konektöre takın ve bir zamanlayıcı başlatın. Kalp tam bir kasılma yaşadığında, basınçları yakından izlerken akışı 0,2 mL / dk’lık artışlarla artırın. İstenen basınçlara ulaşıldığında veya minimum 3,5 mL/dk’ya ulaşılana kadar akıştaki artışları durdurun.Düşük basınçlı perfüzyon30-35 mmHg arasındaki basınçlar için 4,5 mL/dk’lık bir akış kullanın. Adenozin şırınga pompasını çalıştırın. Yüksek basınçlı perfüzyon70-80 mmHg arasındaki basınçlar için minimum 5.0 mL/dk akış kullanın. Adenozin şırınga pompasını çalıştırın. 7. İntraventriküler balon: Konik uçlu (1,4 mm çap) bir balon kateterine (2 mm çapında, 15 cm uzunluğunda) küçük (50 μL) bir lateks balonu takın. Kateteri bir luer kilit konektörü aracılığıyla bir basınç sensörüne bağlayın ve tüm kurulumu bir kelepçe standına sabitleyin. Balon/kateter/basınç sensörünü, basınç sensörünün üst ucuna takılı bir şırınga aracılığıyla yaklaşık 200 μL salin ile doldurun ve sensörün, kateterin ve balonun içindeki kabarcıkları çıkarın. Bir tansiyon aleti kullanarak basınç sensörünü kalibre edin. Sol atriyumun üzerinde küçük bir yatay kesi yapın. Şırıngayı basınç sensörünün üst kısmına çekerek ve sol ventriküle yerleştirerek balonu söndürün. Veri toplamayı başlatın ve diyastolik basınçlar 0 mmHg okuyana kadar balonu şişirin. 8. Örnekleme Perfüzyonun ilk 20 dakikasından sonra ve daha sonra her saat başı kalp atış hızı, aort akışı ve koroner basınçları toplayın. 9. Bitir/temizleme Perfüzyonun sonunda, kalbi sistemden çıkarın ve ödem tahmini için tartın. Kalbin tepesini çevresel bir kesim ile kesin ve perfüzyon sonrası analizler için sıvı nitrojen içinde hızlı dondurma. Histolojik görüntüleme ve boyama için kalbin çevresel bir parçasını kesin. Kalbin ve kanülün geri kalanını atın. Rezervuara bol miktarda deiyonize (DI) su ekleyerek ve peristaltik pompayı çalıştırarak sistemin tüm bileşenlerini durulayın. Suyu harici bir kovada toplayın. Adım 9.4’ü iki ila üç kez tekrarlayın. Tüm numune portlarını ve basınç sensörü borularını iyice durulayın. Rezervuarı sistem genelinde 600 mL DI su ve 3 mL laboratuvar sınıfı deterjan pompası ile doldurun. Su ısıtıcısını, oksijen tankını ve peristaltik pompayı kapatın.