Modifizierte Langendorff-Perfusion zur Verlängerung der Perfusionszeiten von Nagetier-Herztransplantaten

Diese Studie wird in Anlehnung an das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Massachusetts General Hospital durchgeführt. 1. Systemdesign Montieren Sie das System mit den drei doppelwandigen Komponenten, darunter eine Blasenfalle, ein Reservoir, ein Oxygenator, eine Peristaltikpumpe und ein Wasserumwälzsystem. Befestigen Sie alle ummantelten Komponenten an einem Klemmständer. Verbinden Sie die Komponenten nacheinander mit Silikonschläuchen in zwei verschiedenen Sequenzen (Abbildung 1A).Sequenz 1 – Strömungsmuster des Wassers durch den Mantel (durchgezogene Linien in Abbildung 1A):Verbinden Sie den Auslauf des Wasserzirkulators mit einem 36-G-Schlauch mit dem unteren Einlass des Blasenfallenmantels. Dadurch wird gewährleistet, dass das Perfusat auf der richtigen Temperatur (37 °C) gehalten wird, bevor es das Herz erreicht, da das Wasser beim Durchströmen der anderen Komponenten des Systems Wärme verliert. Verbinden Sie den oberen Einlass des Blasenfallenmantels mit dem unteren Einlass des Behältermantels mit einem Schlauch der gleichen Größe. Verbinden Sie anschließend den oberen Einlass des Reservoirmantels mit dem unteren Einlass des Oxygenatormantels. Verbinden Sie abschließend den oberen Einlass des Oxygenators mit dem Zufluss des Wasserzirkulators. Sequenz 2 – Strömungsmuster des Perfusats durch das System (gestrichelte Linien in Abbildung 1A)Befestigen Sie die Luer-Anschlüsse an beiden Seiten des 16-G-Schlauchs. Befestigen Sie das erste Ende am Boden des Reservoirs und führen Sie es durch den peristaltischen Pumpenkopf. Verbinden Sie das andere Ende mit einem der Einlässe der Silikonspule im Oxygenator. Verbinden Sie ein zweites Stück 16-G-Schlauch, das an beiden Enden mit Luer-Lock-Anschlüssen versehen ist, am zweiten Einlass der Silikonspule des Oxygenators mit dem Einlass in der Blasenfalle mit dem langen Vorsprung. Verbinden Sie ein kürzeres Stück 16-G-Schlauch mit Luer-Anschlüssen mit dem ungenutzten Auslass der Blasenfalle mit einem Dreiwege-Luer-Lock-Ventil. Verbinden Sie auf der gegenüberliegenden Seite des Dreiwegeventils ein Stück 16-G-Schlauch mit einem zweiten Luer-Ventil am anderen Ende. Dieses zweite Ventil befindet sich unmittelbar über dem Behälter. Verbinden Sie die gegenüberliegende Seite des Ventils mit weiteren 16-G-Schläuchen, gefolgt vom Drucksensor. Verbinden Sie einen Schlauch mit kleinerem Durchmesser ( ̃3,7 mm) mit einem Konnektor mit der Kanüle (14 G Angiokath) mit dem vertikalen Anschluss des Dreiwegeventils. Das Perfusat fließt durch die Blasenfalle vom Reservoir zum Oxygenator, bevor es durch den Anschluss der Aortenkanüle wieder in das Reservoir zurückfließt. 2. Perfusat-Vorbereitung Bereiten Sie Basenperfusat, 0,96 % Krebs-Henseleit-Puffer, 9,915 mM Dextran, 25 mM Natriumbicarbonat, 1,054 mM Rinderserumalbumin, 1 % Pen-Strepto, 0,13 % Insulin, 0,02 % Hydrocortison, 0,5 % Heparin und 2,75 mM Calciumchlorid vor und bringen Sie es mit destilliertem Wasser auf Volumen. 3. Einrichtung des Perfusionssystems Verbinden Sie zwei 10-ml-Spritzen mit den oberen und seitlichen Entlüftungsöffnungen der Blasenfalle. Geben Sie das Basisperfusat (75 mL) in das Reservoir. Schalten Sie die Schlauchpumpe ein und stellen Sie die Wasserumwälzpumpe auf 37 °C ein. Schließen Sie eine Sauerstoffleitung (95 % O2 und 5 % CO2) an den dritten Einlass des Oxygenators an und sauerstoffisieren Sie das Perfusat mit einem Mindestgehalt vonpO 2 von 400 mmHg. Befestigen Sie eine Injektionsöffnung an der vertikalen Öffnung des Dreiwegeventils unmittelbar hinter der Blasenfalle. Verbinden Sie eine geflügelte Infusionsnadel mit einer 1-ml-Spritze mit dem Injektionsanschluss (der für die Probenahme verwendet wird). Klopfen Sie vorsichtig auf die Injektionsöffnung oder ziehen Sie Perfusat mit der 1-ml-Spritze, um alle Blasen zu entfernen, die in den Kreislauf gelangen. Sobald das Basisperfusat die Temperatur und den Sauerstoffgehalt erreicht hat, führen Sie eine erste Messung der biochemischen Parameter durch, um die korrekte Ionenkonzentration (Tabelle 1) und die richtige Sauerstoffversorgung sicherzustellen.HINWEIS: Der Ionen- und pH-Wert muss abgelesen werden, nachdem die Lösung auf Temperatur (37 °C) gebracht und mit dem richtigen Gasgemisch (95 % O2, 5 % CO2) mit Sauerstoff angereichert wurde. Stellen Sie den Drucksensor auf Null, indem Sie den angeschlossenen Schlauch lösen, und lassen Sie den Perfusatfluss durch den offenen Sensor und die Kanüle ausgleichen. Drücken Sie nach dem Gleichäquirieren die Nulltaste in der Sensorbox und klemmen Sie den Schlauch wieder fest. Zeichnen Sie den Basisdruck auf, bevor das Herz an das System angeschlossen wird, für einen Messwert von 1 ml/min bis 15 mL/min. Niederdruck-PerfusionAdenosin-Tropf: Stellen Sie eine erste Brühe von 20 mM Adenosin im Basisperfusat her. Lösen Sie das Adenosin auf, indem Sie das Röhrchen in ein warmes Wasserbad legen und durch Inversion mischen. Verdünnen Sie das Stammadenosin weiter auf eine Konzertierung von 0,06 mg/ml in Base Perfusat und geben Sie es in eine 50 mL Spritze. Befestigen Sie eine geflügelte Infusionsnadel an der 50-ml-Spritze und verbinden Sie sie mit dem Injektionsanschluss im Dreiwegeventil. Befestigen Sie die Spritze an einer Spritzenpumpe und stellen Sie sie auf eine Infusionsgeschwindigkeit von 166,6 μl/min ein.HINWEIS: Blasen werden durch leichtes Klopfen oder Schnippen aus dem Infusionsanschluss freigesetzt. Hochdruck-Perfusion:Isolierung von gepackten roten Blutkörperchen (pRBCs):Entnahme von 10-12 ml Vollblut der Ratte durch Herzpunktion einer Spenderratte. Das Blut bei 2000 x g 10 min zentrifugieren. Entfernen Sie die Plasma- und Buffy-Coat-Schicht durch Pipettieren. Resuspendieren Sie die pRBCs in Perfusat ohne Calciumchlorid im Verhältnis 1:1 (z. B. 5 mL pRBCs: 5 mL Perfusat) durch Inversionsmischung. Wiederholen Sie die Schritte 3.8.1.2-3.8.1.4 zweimal für insgesamt 3 Wäschen. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen im Verhältnis 1:1 in Perfusat und geben Sie die Mischung in das Perfusionssystem, das bereits die 75 ml Baseperfusat enthält. Lassen Sie die Zellen gleichmäßig im System verteilen und messen Sie den Hämatokrit des Perfusats mit einem Hämatologiegerät. Der Hämatokrit liegt zwischen 5 % und 7 %. 4. Vorbereitung der Beschaffung von Herztransplantaten Grundieren Sie das Perfusionssystem vollständig, bevor Sie mit der Beschaffung beginnen, um die Zeit der kalten Ischämie zu minimieren. Bereiten Sie die chirurgischen Instrumente vor. Zu den chirurgischen Instrumenten gehören blaue Pads, chirurgisches Klebeband, 5-0-Seidennähte, Wattestäbchen, Kochsalzspritzen (50 mL und 10 mL), Operationsscheren, Pinzetten, Mikroscheren, Mikrozangen, Halstead-Klemme, 30 U Heparin, 16 G Schläuche für die Portalspülung, 14 G Schläuche für die Kanulation des Herzens, 16 G Angiokath, modifizierte 14 G Angiokath mit Manschette, Drucksensor, Eiskübel mit Eis, 47 mm Petrischale, Gaze. Erstellen Sie eine modifizierte Kanüle, indem Sie einen dünnen Schlauchring (Innendurchmesser [ID] 0,167 mm, Außendurchmesser [OD] 2,42 mm) auf die 14-G-Kanüle einführen, um einen Manschetteneffekt zu erzeugen.Entfernen Sie die Nadel der Kanüle und geben Sie einen Tropfen Sekundenkleber unter den Ring. Schieben Sie den Ring vorsichtig bis zu 1/4 Zoll über die Basis der Kanüle. Lassen Sie den Kleber vor dem Gebrauch trocknen. Schneiden Sie die Kanüle so nah wie möglich an der Manschette schräg ab und entfernen Sie scharfe Kanten. Füllen Sie eine 60-ml-Spritze mit heparinisierter Kochsalzlösung (0,03 U/ml) für die Pfortaderspülung. Schließen Sie die Spritze an den Drucksensor an, gefolgt von dem 16-G-Spülschlauch. Schließen Sie eine 10-ml-Spritze mit heparinisierter Kochsalzlösung (0,03 U/ml) an die 14-G-Sonde an. Verbinden Sie das andere Ende des Schlauchs mit der Aortenkanüle und spülen Sie, um Luftblasen zu entfernen. Legen Sie die Aortenkanüle in eine 47 mm Petrischale, die mit Gaze gefüllt und mit Kochsalzlösung gefüllt ist. Lassen Sie die Petrischale auf Eis, bis das Herz mit dem Perfusionssystem verbunden ist. 5. Beschaffung von Herztransplantaten Betäuben Sie die Ratten in einer Narkosekammer mit 3% Isofluran. Sobald die Reflexe nicht bemerkt werden, nehmen Sie die Ratte aus der Kammer, setzen Sie sie in den Operationsraum und geben Sie kontinuierlich Isofluran (3%) über eine Gesichtsmaske ab. Nach dem Zehenkneiftest heparinisieren Sie das Tier durch die Penisvene mit 30 U Heparin. Rasieren Sie die Ratte über den gesamten Bauch und den oberen Brustbereich. Entfernen Sie die Fellspäne aus dem Operationsfeld. Kleben Sie jedes Glied ab, um sicherzustellen, dass sich während der Operation keine Bewegungen bewegen. Machen Sie einen horizontalen Schnitt in der Mittellinie in der Haut des Unterbauchs, wodurch die Bauchmuskeln freigelegt werden. Machen Sie einen zweiten horizontalen Schnitt in der Mittellinie in den Bauchmuskeln, der die inneren Organe freilegt. Legen Sie das Brustbein frei, sichern Sie es mit einem Hämostatat und ziehen Sie es kranial zurück, um die Leber und die Pfortader freizulegen. Kanülieren Sie die Pfortader mit einem 16-Gauge-Angiokath. Befestigen Sie die 60-ml-Spritze mit heparinisierter Kochsalzlösung am Angiokath und erstellen Sie einen Schnitt in der unteren Hohlvene und der Bauchschlagader zur Entlüftung. Spülen Sie die volle Menge Kochsalzlösung durch die Pfortader.HINWEIS: Der Spüldruck sollte bei etwa 10 mmHg bleiben. Machen Sie einen horizontalen Schnitt im Zwerchfell, gefolgt von einem proximalen Schnitt durch die Rippen auf beiden Seiten des Brustbeins, um die Brusthöhle freizulegen. Nehmen Sie das Herz aus dem Hohlraum und legen Sie es sofort mit Kochsalzlösung auf Eis auf die Petrischale. Identifizieren Sie den Aortenbogen, klemmen Sie mit Hämostaten und legen Sie die absteigende Aorta frei, indem Sie das verbleibende Bindegewebe reinigen. Machen Sie einen horizontalen Schnitt auf halber Höhe der absteigenden Aorta und kanülieren Sie mit dem 14 G Angiokath.HINWEIS: Brechen Sie die Aortenklappe nicht mit der Kanüle auf. Sichern Sie die Kanüle über eine Naht oberhalb der Manschette und lösen Sie den Hämostat. Lassen Sie das Herz auf Eis bleiben, bis es in das Perfusionssystem gelegt wird. 6. Einleitung der Perfusion Stellen Sie den Durchfluss der Schlauchpumpe auf 1,0 mL/min ein.HINWEIS: Die Aortenkanüle wird immer in einem 90°-Winkel zum Herzen geführt, um das Einbringen von Blasen in die Herzkranzgefäße zu vermeiden (Abbildung 1B). Wiegen Sie das Herz mit der Kanüle, bevor Sie das Herz am System befestigen.HINWEIS: Die Aortenkanüle sollte vollständig frei von Luftblasen sein. Befestigen Sie die Kanüle an dem Konnektor im System und starten Sie einen Timer. Sobald das Herz eine vollständige Kontraktion hat, erhöhen Sie den Fluss in Schritten von 0,2 ml/min, während Sie den Druck genau beobachten. Stoppen Sie den Anstieg des Durchflusses, wenn der gewünschte Druck erreicht ist oder bis ein Minimum von 3,5 mL/min erreicht ist.Niederdruck-PerfusionFür Drücke zwischen 30 und 35 mmHg ist ein Durchfluss von 4,5 ml/min zu verwenden. Starten Sie die Adenosin-Spritzenpumpe. Hochdruck-PerfusionFür Drücke zwischen 70 und 80 mmHg ist ein Mindestdurchfluss von 5,0 ml/min zu verwenden. Starten Sie die Adenosin-Spritzenpumpe. 7. Intraventrikulärer Ballon: Befestigen Sie einen kleinen (50 μl) Latexballon an einem Ballonkatheter (2 mm Durchmesser, 15 cm lang) mit einer konischen Spitze (1,4 mm Durchmesser). Verbinden Sie den Katheter über einen Luer-Lock-Anschluss mit einem Drucksensor und befestigen Sie das gesamte Setup an einem Klemmständer. Füllen Sie den Ballon/Katheter/Drucksensor mit ca. 200 μl Kochsalzlösung über eine Spritze, die am oberen Ende des Drucksensors angebracht ist, und entfernen Sie Blasen aus dem Inneren des Sensors, des Katheters und des Ballons. Kalibrieren Sie den Drucksensor mit einem Blutdruckmessgerät. Machen Sie einen kleinen horizontalen Schnitt über dem linken Vorhof. Entleeren Sie den Ballon, indem Sie die Spritze an der Oberseite des Drucksensors ziehen und in den linken Ventrikel einführen. Starten Sie die Datenerfassung und blasen Sie den Ballon auf, bis der diastolische Druck 0 mmHg anzeigt. 8. Probenahme Erfassen Sie die Herzfrequenz, den Aortenfluss und den Koronardruck nach den ersten 20 Minuten der Perfusion und danach jede Stunde. 9. Ende/Aufräumen Am Ende der Perfusion nehmen Sie das Herz aus dem System und wiegen es zur Ödemabschätzung. Schneiden Sie die Herzspitze über einen umlaufenden Schnitt und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff für die Postperfusionsanalyse ein. Schneiden Sie ein umlaufendes Stück des Herzens für die histologische Bildgebung und Färbung. Entsorgen Sie den Rest des Herzens und der Kanüle. Spülen Sie alle Komponenten des Systems, indem Sie große Mengen deionisiertes (DI) Wasser in den Behälter geben und die Schlauchpumpe laufen lassen. Sammle das Wasser in einem externen Eimer. Wiederholen Sie Schritt 9.4 zwei- bis dreimal. Spülen Sie alle Messanschlüsse und Drucksensorschläuche gründlich aus. Füllen Sie den Behälter mit 600 mL DI-Wasser und 3 mL Waschmittelpumpe in Laborqualität im gesamten System. Schalten Sie den Warmwasserbereiter, den Sauerstofftank und die Schlauchpumpe aus.