Modelado avanzado de aneurisma de aorta abdominal en ratones mediante combinación de elastasa tópica y ß-aminopropionitrilo oral
Summary
Este protocolo describe un enfoque quirúrgico metódico para modelar aneurismas de aorta abdominal avanzados en ratones mediante una combinación de aplicación directa de elastasa a la aorta infrarrenal y administración de ß-aminopropionitrilo a través del agua potable.
Abstract
El modelo murino de elastasa tópica de aneurisma de aorta abdominal (AAA) mejora cuando se combina con agua potable suplementada con ß-aminopropionitrilo (BAPN) para producir de manera confiable verdaderos aneurismas infrarrenales con comportamientos que imitan los AAA humanos. La aplicación tópica de elastasa a la adventicia de la aorta infrarrenal provoca daño estructural en las capas elásticas de la pared aórtica e inicia la dilatación del aneurisma. La coadministración de BAPN, un inhibidor de la lisil oxidasa, promueve la degeneración sostenida de la pared al reducir la reticulación de colágeno y elastina. Esta combinación da lugar a grandes AAA que se expanden progresivamente, forman trombos intraluminales y son capaces de romperse. El perfeccionamiento de las técnicas quirúrgicas, como el aislamiento circunferencial de todo el segmento aórtico infrarrenal, puede ayudar a estandarizar el procedimiento para una aplicación consistente y completa de la elastasa pancreática porcina a pesar de los diferentes operadores y las variaciones anatómicas entre ratones. Por lo tanto, el modelo de elastasa/BAPN es un enfoque refinado para la inducción quirúrgica de AAA en ratones, que puede recapitular mejor los aneurismas humanos y proporcionar oportunidades adicionales para estudiar el crecimiento de los aneurismas y el riesgo de ruptura.
Introduction
Un aneurisma se define como una dilatación patológica de un vaso sanguíneo mayor del 50% del diámetro del vaso sano1. A pesar de que los aneurismas de aorta abdominal (AAA) son una afección común en la población envejecida, con una incidencia de aproximadamente el >5% de los hombres > 65 años de edad, no existen estrategias terapéuticas dirigidas para tratar el AAA1. El tratamiento actual del AAA se limita a la reducción de los factores de riesgo y a la reparación quirúrgica con cirugía abierta o endovascular basada en el diámetro aórtico o la tasa de crecimiento2. El mayor peligro del AAA es la rotura del aneurisma, que es mortal si no se trata, y la reparación en este entorno emergente puede conllevar riesgos de mortalidad de hasta el 90%1.
La fisiopatología del AAA es complicada, multifactorial y no se comprende completamente3. Las características del AAA humano incluyen una verdadera dilatación aneurismática de la pared aórtica con infiltración de células inflamatorias, la presencia de trombo intraluminal y una dilatación progresiva que conduce a una eventual ruptura 3,4. Además, los AAA se asocian con la edad avanzada, tienen un predominio sexual masculino:femenino de 9:1 y ocurren con mayor frecuencia en la aorta infrarrenal5. Modelar todas las características y comportamientos de los AAA humanos en animales sigue siendo un desafío continuo6.
El modelo actual de AAA se lleva a cabo principalmente en ratones, y los aneurismas se inducen comúnmente utilizando uno de tres métodos: por infusión de angiotensina II (AngII) a través de una bomba osmótica implantada subcutáneamente, y por aplicación directa de cloruro de calcio (CaCl2) o elastasa a la aorta7. En este último método, la elastasa pancreática porcina (EPP) se aplica a un segmento de la aorta infrarrenal y provoca la degradación enzimática de las fibras de elastina dentro de la lámina elástica de la túnica media. Este daño estructural resulta en el debilitamiento de la pared aórtica y la dilatación externa del aneurisma. Sin embargo, el uso de elastasa tópica sola produce aneurismas infrarrenales relativamente pequeños, que no se agrandan ni se rompen progresivamente con el tiempo. Más recientemente, Lu et al. mejoraron este modelo mediante la administración adicional de β-aminopropionitrilo (BAPN), un inhibidor irreversible de la lisil oxidasa, a sus ratones tratados con elastasa. Al evitar la reticulación de las fibras de elastina y colágeno, la suplementación con BAPN hace que las aortas dañadas por la elastasa se dilaten progresivamente hasta el punto de ruptura. Además, el modelo de elastasa/BAPN tiene una mayor tasa de incidencia de AAA que el modelo de elastasa tópica, y los aneurismas producidos también son más grandes y contienen trombo intraluminal8.
En el modelo de elastasa/BAPN, el grado de disección quirúrgica y la exposición de la aorta a la elastasa pueden afectar el éxito y la replicabilidad de este modelo. En este manuscrito, describimos que la co-administración de agua potable de BAPN y la aplicación tópica de elastasa a la aorta después del aislamiento circunferencial de todo el segmento aórtico infrarrenal mejora la replicabilidad, explica las diferencias anatómicas entre animales y da como resultado una mayor tasa de inducción de AAA, tamaños de aneurismas e incidencia de rupturas. En este artículo, describiremos un enfoque estandarizado para inducir de manera confiable aneurismas de aorta abdominal avanzados en ratones utilizando una combinación de elastasa tópica y agua suplementada con BAPN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprender la compleja fisiopatología del AAA es fundamental para mejorar el tratamiento de la enfermedad por aneurisma aórtico. Si bien se desarrollan activamente nuevas estrategias para mejorar los resultados quirúrgicos, los AAA siguen siendo prevalentes en nuestra sociedad envejecida y la ruptura de un aneurisma sigue siendo una de las principales causas de muerte enlos Estados Unidos. Por lo tanto, las necesidades insatisfechas en las estrategias de detección, prevención y tratamiento de AAA justifican una mayor investigación fundamental sobre el aneurisma11.
Los modelos animales que recapitulan de manera precisa y eficiente las características y comportamientos de los AAA humanos son esenciales para los estudios mecanicistas de la fisiopatología de los aneurismas y la identificación de posibles objetivos terapéuticos. Si bien los modelos animales actuales pueden imitar los aspectos principales de los cambios aneurismales que ocurren en las enfermedades humanas, ningún modelo único representa completamente la verdadera complejidad de los AAA humanos. En la actualidad, los ratones son la especie más ampliamente aceptada para el modelado animal de AAA. Los investigadores deben considerar las diversas fortalezas y debilidades de cada modelo murino para su estudio particular de aneurisma, como los descritos por expertos en las revisiones de Daugherty et al. y Busch et al.12,13.
El uso de elastasa para inducir AAA en roedores fue descrito por primera vez por Anidjar et al. en 1990:14. La perfusión de la aorta con elastasa pancreática porcina mediante una bomba de jeringa crea una dilatación inicial de aproximadamente entre el 50% y el 70%, y los segmentos dilatados muestran favorablemente características patológicas similares a las de los AAA humanos, como la degeneración medial y la inflamación adventicia. Sin embargo, el modelo clásico de perfusión es posiblemente el modelo de aneurisma más desafiante desde el punto de vista técnico, y los aneurismas que generalmente se forman en la segunda semana comienzan a resolverse gradualmente a partir de entonces. Bhamidipati et al. en 2012 demostraron que la aplicación adventicial de elastasa también podría inducir con éxito aneurismas similares que son más reproducibles en tamaño15. Un modelo mucho menos desafiante, el modelo de elastasa tópica se adoptó ampliamente en la investigación de aneurismas. La metodología adicional y las ventajas del modelo de elastasa tópica se discuten en el artículo de métodos de Xue y colegas16.
El modelo elastasa/BAPN del AAA murino fue desarrollado por Lu y sus colegas en 20178. La introducción del agua potable con un 0,2% de BAPN mejoró muchas de las críticas al modelo clásico de elastasa tópica, que ahora produce aneurismas que se expanden continuamente hasta el punto de la ruptura del AAA. En su estudio de 2017, demostraron que los ratones del grupo tratado con elastasa/BAPN tenían tasas de formación de AAA significativamente más altas en comparación con el grupo de elastasa (93% frente a 65%, P 800% y formaron trombo intraluminal (53,8%), y el 46,2% se rompieron espontáneamente antes del final del experimento. Este modelo ha permitido a los investigadores investigar factores que pueden afectar la progresión y la estabilidad del aneurisma a lo largo del tiempo.
Berman et al. exploraron más a fondo el modelo de elastasa/BAPN variando la concentración de elastasa tópica, la duración del estudio, el momento de la administración de BAPN y el impacto del sexo del animal9. El tratamiento con 5 μL de elastasa de mayor concentración (5 mg/mL o 10 mg/mL) produjo aneurismas más grandes que 2,5 mg/mL durante 56 días. La prevalencia de la formación de trombos intraluminales también dependió de la concentración de elastasa, que se produjo en el 28,6% de los ratones tratados con 5 mg/mL y en el 62,5% de los ratones tratados con 10 mg/mL. También demostraron que el modelo de elastasa/BAPN podía inducir aneurismas en ratones hembra. Aunque solo se estudiaron unos pocos ratones hembra (n = 5), encontraron que los aneurismas en las hembras eran más propensos a romperse (2 de 5 ratones) y eran significativamente más grandes que los AAA masculinos a los 56 días.
En este artículo, nuestro objetivo es proporcionar un método para abordar una de las mayores limitaciones del modelado quirúrgico, que es la variación en el procedimiento quirúrgico. Sin un consenso claro sobre el grado de disección y el área de la aorta tratada con elastasa, los resultados de este modelo podrían variar drásticamente entre animales, investigadores e instituciones. Hemos observado numerosas variaciones anatómicas entre ratones, incluyendo el número y tamaño de las arterias y venas lumbares, y la localización del IMA, el despegue de la vena gonadal izquierda, entre otras, que pueden ser limitantes cuando se intenta tratar solo una porción o segmento específico de la aorta infrarrenal. Aquí, demostramos que la disección circunferencial de toda la longitud de la aorta infrarrenal desde la arteria renal izquierda proximalmente a la bifurcación aórtica distalmente ayuda a proporcionar grados reproducibles de exposición aórtica a pesar de las diferencias anatómicas, al tiempo que aumenta el éxito de la inducción del aneurisma y proporciona límites claros para el operador. Además, el tamaño y la posición más anterior de la VCI tienden a cubrir la mayor parte de la aorta, lo que puede afectar la cantidad de aorta tratada si no se aísla de la VCI. Si bien es necesario extirpar la fascia retroperitoneal para exponer la aorta, es importante no diseccionar completamente el tejido conectivo de la adventicia de la aorta y exponer ninguna de las capas medias, ya que esto generalmente resulta en una ruptura durante el período de incubación de elastasa de 5 minutos. Esto podría servir como un control interno adicional al grado de disección con este modelo, pero puede ser una curva de aprendizaje frustrante al adoptar este modelo. Además, los operadores aprenderán las áreas de mayor riesgo (Figura 4) que pueden lesionarse fácilmente durante la cirugía y provocar una hemorragia incontrolable.
Si bien es importante que los pasos del procedimiento de este modelo sean coherentes, la duración del estudio y el momento de la ecografía de intervalo pueden variar según el objetivo de la investigación. La dilatación aórtica comienza inmediatamente con la aplicación de elastasa, sin embargo, los estudios que utilizan este modelo suelen seguir a los ratones durante 28 días después de la cirugía7, como en este experimento de ejemplo. Se debe considerar la extensión de la duración del estudio cuando se estudian AAA avanzados, crecimiento a largo plazo, formación de trombos intraluminales o ruptura.
Las medidas perioperatorias adicionales, como mantener la temperatura corporal y el estado de hidratación de los animales, pueden ayudar a mejorar la supervivencia de los animales a este procedimiento invasivo. El uso de una almohadilla térmica durante la cirugía y la colocación en una jaula de recuperación tibia pueden ayudar a evitar la hipotermia. La solución salina debe calentarse antes de usarla para irrigar la cavidad abdominal. Un bolo de líquido subcutáneo inmediatamente después de la cirugía puede explicar pérdidas insensibles de líquido durante la operación y ayudar al animal a mantener una hidratación adecuada durante la fase de recuperación inmediata. Con un manejo cuidadoso de los tejidos y un enfoque metódico consistente, el modelo de elastasa/BAPN puede ser realizado por un operador experimentado entre 30 min y 45 min por ratón y producir de manera confiable AAA con complicaciones perioperatorias muy bajas.
Nuestros resultados demuestran que la combinación de BAPN además de la disección circunferencial de la aorta infrarrenal antes de la aplicación de elastasa produce AAAs grandes y en continua expansión, con diámetros mayores e incidencia de ruptura en períodos más cortos. En este experimento, los AAA se indujeron con éxito en todos los ratones machos (6 de 6) y hembras (6 de 6) tratados con elastasa activa. La exposición a la elastasa durante 5 minutos resultó en un aumento inmediato del diámetro aórtico en aproximadamente un 30-40%, lo que es útil para confirmar la aplicación exitosa y consistente de elastasa entre los grupos de tratamiento. Al igual que Berman et al., hemos demostrado que este modelo puede inducir AAAs en ratones hembra, que también tienen una mayor respuesta a la ruptura que los machos. La mitad de los ratones hembra (3 de 6) se rompieron dentro de los 28 días, en comparación con 0 de 6 de los machos, sin embargo, los ratones hembra pesan menos que los machos. Los ratones machos demostraron un aumento en el diámetro de AAA en un 257% en comparación con el -4% de los controles masculinos, mientras que las hembras sobrevivientes mostraron un aumento del diámetro del 417%, en comparación con el -16% de las hembras de control. Los diámetros aórticos no fueron significativamente diferentes entre los ratones macho y hembra tratados a los 28 días debido al mayor número de rupturas en el grupo de hembras. Especulamos que los ratones simulados exhiben diámetros aórticos más pequeños al final del estudio, ya que la aorta tiende a dilatarse ligeramente durante la disección inicial y luego forma tejido cicatricial a los 28 días.
El modelo elastasa/BAPN posee ciertas limitaciones. La disección circunferencial de la aorta requiere habilidades quirúrgicas finas, pero ayuda a mejorar la replicabilidad y el grado de inducción del aneurisma. Al igual que el modelo de elastasa tópica, también hay un efecto de lote en la actividad de la enzima elastasa, que, como se mencionó anteriormente, es importante utilizar la misma botella de elastasa para todos los animales en un experimento determinado. Si bien la incidencia de trombo y ruptura intraluminal del AAA aumenta con el tiempo y la gravedad del aneurisma, estos no están garantizados ni son totalmente predecibles en este modelo.
En resumen, el modelo de elastasa/BAPN produce AAAs infrarrenales grandes y verdaderos en ratones machos y hembras, que se expanden progresivamente con el tiempo, forman trombos intraluminales y son capaces de romperse. Estas fortalezas de este modelo murino ayudan a recapitular mejor algunos de los comportamientos y características de los aneurismas en humanos. Aunque técnicamente difícil, la disección cuidadosa y completa de la aorta puede aumentar la respuesta aneurismática. En la actualidad, el método elastasa/BAPN es un modelo avanzado para el estudio de los aneurismas de aorta abdominal infrarrenal.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación contó con el apoyo del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número 1R01HL149404-01A1 (BL), y el Premio Ruth L. Kirschstein del Servicio Nacional de Investigación T32 HL 007936 al Centro de Investigación Cardiovascular (JB) de la Universidad de Wisconsin-Madison. Las figuras fueron creadas o editadas con Biorender.com. El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 10.
Materials
| 0.5 L induction chamber | Kent Scientific Corporation | SOMNO-0530XXS | anesthesia induction chamber |
| 0.9% sodicum chloride injection, USP, 20 mL | Hospira | NDC 0409-4888-03 | normal saline |
| 3 mL syringe Luer-Lok Tip with BD PrecisionGlide Needle 22 G x 3/4 | BD | REF 309569 | syringe, 22 G needle |
| 3-Aminopropionitrile Fumarate | TCI | A0796 | BAPN |
| 3-Aminopropionitrile Fumarate salt | Sigma-Aldrich | A3134-25G | BAPN |
| Avant Delux gauze sponges, 2" x 2" 4-Ply | Medline | NON26224 | gauze sponges |
| Balding clipper | Whal Clipper Corporation | 8110 | hair clippers |
| betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Avrio | NCD 67618-154-16 | betadine surgical scrub |
| blunt forceps | ROBOZ | RS-5130 | blunt forceps |
| Buprenorphine ER-lab | ZooPharm | BERLAB0.5 | buprenorphine |
| carprofen | Norbrook | NDC 55529-131-11 | carprofen |
| CASTROVIEJO 5.75" straight with lock | ROBOZ | RS-6412 | Castroviejo needle driver |
| cotton tipped wood applicators, 6" | Dynarex | No. 4302 | cotton tipped wood applicators |
| DESMARRES 5.5' rectractor | ROBOZ | RS-6672 | skin rectractor |
| digital caliper, 0-150 mm | World Precision Instruments | 501601 | digital caliper |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Elastase from porcine pancrease Type I | Sigma-Aldrich | E1250-10MG | elastase >4.0 units/mg protein |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | ethanol diluted to 70% |
| eye lube | Optixcare | 14716 | eye lube |
| Germinator 500 dry sterilizer | CellPoint Scientific, Inc | 5-1450 | dry bead sterilizer |
| heat therapy mat | Adroit Medical Systems | V016 | heat therapy mat |
| heat therapy pump | Adroit Medical Systems | HTP-1500 | heat therapy pump |
| isoflurane, USP | Akorn Animal Health | NCD 59399-106-01 | isoflurane |
| L-10 pipette | Rainin | LTS 0.5-10 uL | pipette |
| Low profile anesthesia mask, small | Kent Scientific Corporation | SOMNO-0801 | anesthesia nose cone |
| micro dissector scissors | ROBOZ | RS-5619 | micro dissector scissors |
| microscope | Leica | S9i | microscope |
| Nii-LED high intensity LED illuminatorLED exertnal light | Nikon Instruments, Inc | 83359 NII-LED | external dissection light |
| nylon 5-0 monofilament, black non-absorbable suture | Oasis | MV-661-V | 5-0 nylon suture |
| polyisoprene surgical gloves, GAMMEX Non-Latex PI Micro, size 7.5 | Ansell | 20685975 | non-latex surgical gloves |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips | CellPoint Scientific, Inc | 203-1000 | wound clips |
| scale | Ohaus | Compass CR2200 | scale |
| SomnofFlo Accessory Kit | Kent Scientific Corporation | 10-8000-71 | tubing for electronic vaporizer |
| SomnoFlo electronic vaporizer | Kent Scientific Corporation | SF2992 | low-flow electronic vaporizer |
| SomnoPath Flow Diverter | Kent Scientific Corporation | SP1016 | flow diverter for electronic vaporizer |
| SS/45 sharp forceps | ROBOZ | RS-4941 | sharp forceps |
| surgical scissors | ROBOZ | RS-6010SC | surgical scissors |
| vessel forceps | Dumont | VES 0.35 | vessel forceps |
References
- Kent, K. C. Clinical practice. Abdominal aortic aneurysms. New Engl J Med. 371 (22), 2101-2208 (2014).
- Wanhainen, A., et al. European Society for Vascular Surgery Guidelines on the management of aorto-iliac abdominal aortic aneurysms. Eur J Vasc Endocasc Surg. 57 (1), 8-93 (2019).
- Shimizu, K., Mitchell, R. N., Libby, P. Inflammation and cellular immune responses in abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 987-994 (2006).
- Shen, Y. H., et al. Aortic aneurysms and dissections series. ArteriosclerThromb Vasc Biol. 40 (3), e37-e46 (2020).
- Stanley, J. C., Veith, F., Wakefield, T. W. . Current Therapy in Vascular and Endovascular Surgery E-Book. , (2014).
- Morgan, S., et al. Identifying novel mechanisms of abdominal aortic aneurysm via unbiased proteomics and systems biology. Front Cardiovasc Med. 9, 889994 (2022).
- Yin, L., Kent, E. W., Wang, B. Progress in murine models of ruptured abdominal aortic aneurysm. Front Cardiovasc Med. 9, 950018 (2022).
- Lu, G., et al. A novel chronic advanced stage abdominal aortic aneurysm murine model. J Vasc Surg. 66 (1), 232-242.e4 (2017).
- Berman, A. G., et al. Experimental aortic aneurysm severity and growth depend on topical elastase concentration and lysyl oxidase inhibition. Sci Rep. 12 (1), 99 (2022).
- . Disease Control and Prevention Deaths, percent of total deaths, and death rates for the 15 leading causes of death in 5-year age groups, by race, and sex Available from: https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm (2015)
- Dansey, K. D., et al. Epidemiology of endovascular and open repair for abdominal aortic aneurysms in the United States from 2004 to 2015 and implications for screening. J Vasc Surg. 74 (2), 414-424 (2021).
- Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
- Busch, A., et al. Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery. JVS Vasc Sci. 2, 219-234 (2021).
- Anidjar, S., et al. Elastase-induced experimental aneurysms in rats. Circulation. 82 (3), 973-981 (1990).
- Bhamidipati, C. M., et al. Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase. Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).
- Xue, C., Zhao, G., Zhao, Y., Chen, Y. E., Zhang, J. Mouse abdominal aortic aneurysm model induced by perivascular application of elastase. J Vis Exp. (180), 63608 (2022).
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