局所エラスターゼと経口β-アミノプロピオニトリルの組み合わせによるマウスにおける高度な腹部大動脈瘤モデリング

動物プロトコルは、ウィスコンシン大学マディソン校の動物管理および使用委員会(M005792)によって承認されています。 1. 動物の飼育 標準的なメンテナンスチャウでマウスを育てます。成体マウスまたは若年成体マウス(生後8〜12週齢)を使用してください。注:成体を使用すると、動物が完全に成熟し、大動脈径の変化が動物の成長に関連している可能性が制限されます。この研究では、手術時に22〜24週齢の雄と雌のC57BL / 6Jマウスを利用しました。Luらは、若年マウスと高齢マウスの間で動脈瘤反応に有意差は観察されなかった8。さらに、ほとんどの動脈瘤モデリングは雄マウスで行われるが、このモデルは雄マウスと雌マウスの両方でAAAを成功裏に誘導する9。 試験期間を決定し、動物を治療群または偽(対照)群に割り当てます。0.2% BAPN 飲料水を治療群マウスに投与し、活性エラスターゼを腎下大動脈に局所適用して手術を受けさせます。未処理の水を投与して動物を制御し、変性エララスターゼを大動脈下に適用して手術を受けさせます。. 2. B-アミノプロピオニトリル(BAPN)を添加した飲料水の開始 手術の2日前に、0.2PN飲料水でマウスの治療を開始します。BAPN水を大量に調製し、4°Cの暗所で最大28日間保管します。BAPN水がマウスに与える前に、室温に達していることを確認してください。注: BAPN 水は、研究期間中 7 日ごとにケージ内で交換することをお勧めします。 3. 手術当日 材料準備 手術用手袋を5 mm x 10 mmのストリップにカットし、後でエラスターゼで治療する前に大動脈を分離するために使用されます。サージカルドレープの中央に~1.5cm×3cmサイズの楕円形を切って、サージカルドレープを準備します。2インチ×2インチのガーゼを広げて半分にカットし、約2.5cm×10cmのガーゼを作り、後で腹部の内容物を引っ込めるときに使用します。すべての手術器具をオートクレーブ処理し( 材料の表を参照)、 図1の例に示すように無菌の手術野を設定します。 図1:AAAのエラスターゼ/BAPNマウスモデルの準備における無菌手術のセットアップ例。 略語:BAPN = ß-アミノプロピオニトリル;AAA = 腹部大動脈瘤。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 ヒートランプの下に清潔なケージを置き、生理食塩水をランプの近くに置いて体温(37°C)まで温めて、術後の回復ケージを準備します。ヒートランプが安全な位置にあることを確認し、リカバリーケージと生理食塩水が温まっているが、37°Cを超えないようにします。 ウォーターポンプをオンにして、加熱パッドに温水を循環させ始めます。 4.手術のための動物の準備 マウスを誘導チャンバーに入れ、低流量の電子気化器を使用して 5% イソフルランを 200 mL/分で麻酔します。麻酔をかけながら、各マウスの体重を量り、鎮痛のために0.6 mg / kgのブプレノルフィンERと20 mg / kgのカルプロフェンを皮下投与します。.電動ヘアトリマーを使用して、下腹部からキシポイド突起の下腹部まで、腹部の毛皮をクリップします。ガーゼまたはラボ用ワイプを使用して、余分な髪をブラッシングします。マウスをケージに戻し、鎮痛効果が出るまで少なくとも20分待ってから手術を進めます。 鎮痛剤を投与してから少なくとも20分後、マウスを麻酔導入チャンバーに入れ、マウスが鎮静するまで、低流量電子気化器を使用して5%イソフルランを200 mL / minで再度送達します。. 鎮静剤を投与したマウスを誘導室から取り出し、手術野に仰向けに置きます。アイジェルを塗布し、ノーズコーンをサージカルテープで固定します。送達された吸入イソフルランを50mL / minで1〜2%の維持率に減らします。.マウスの前足と後足をサージカルテープで固定します。 マウスの下腹部に膀胱がないか調べます。親指、人差し指、中指の間の膀胱にそっと外圧を加えて、排尿を誘発します。その間、ガーゼを使用して尿を吸い取ります。注:術野を汚染しないように注意してください。 ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブと綿先の綿棒で70%アルコールを塗布して、腹部の消毒を開始します。腹部の中央から始めて、円を描くように3倍外側に働きます。アプリケーション間で領域を短時間乾かします。 麻酔が適切であることを確認するために、つま先をつまむ反応がないことを確認してください。ノーズコーンと手足が固定されていることを確認してください。マウスに外科用ドレープをかぶせ、開口部を外科的に準備した腹部の真上に置きます。メモ: 汚染の可能性を避けるために、ドレープをマウス上でドラッグしないでください。 5. AAAの外科的導入 腹腔に入る:手を洗い、清潔なニトリルまたは滅菌手術用手袋を着用してください。手術場に接触する前に、必ず手袋に70%のEtOHをスプレーし、手袋をはめた手を乾くまでこすり合わせてください。 鈍い鉗子を使用して、腹部の正中線の皮膚をテントで覆います。手術用ハサミを使用して皮膚に小さな傷をつけ、切開部を縦方向に約2〜3cmの長さに伸ばします。 鉗子を使用して直腸筋を持ち上げ、半透明の白筋線を特定します。はさみを使用して、リネアアルバから腹腔に入り、次にリネアアルバに沿って近位および遠位に伸ばします。 腹部大動脈の露出:ガーゼのストリップと2つの綿棒を温めた生理食塩水で湿らせます。ガーゼの一方の端を半分までしっかりと転がして腹部のロールを作成し、たっぷりとした尾を残します。 スキンリトラクターを使用して、右腹壁を引っ込めます。 湿らせた綿棒を使用して、小腸と大腸を左上象限まで優しく掃くことにより、右内側内臓回転を行い、大動脈と下大静脈(IVC)を視覚化します。腹部をロールして腸を視界から外します–ガーゼの丸められた端を腸の下に押し込み、次に尾の端を体の周りに出して腸を優しく包みます。ガーゼの裾にやさしい張力をかけて、腸を視界から遠ざけます。図2Aに示すように、腹部ロールとスキンリトラクターを調整して、後腹膜器官の最適なビューを取得します。注:腹部ロールは、腸を湿らせ、手術器具による不注意な損傷から保護するのに役立ちます。腸が乾燥するのを防ぐために、処置中はガーゼが湿ったままであることを確認してください。腸を無理に引っ込めると、上腸間膜動脈や腸管系のねじれを引き起こし、虚血性損傷を引き起こす可能性があるため、腸を引っ込めないように注意してください。また、最初に小腸を掃くときは、大腸と下肝(肝結腸靭帯)の間に薄い半透明の付着物があり、注意しないと肝臓のカプセルが簡単に引き裂かれて出血を引き起こす可能性があるので注意が必要です。引っ込め中にこの靭帯に張力がある場合は、はさみで鋭く分割します。 図2:腹部の収縮の表現とマウスの腎下大動脈の露出に最適な外科的見解 (A)ガーゼの腹部ロールの配置は、腹腔内臓器の収縮を助け、反対側の開創器は後腹膜の視覚化を提供するのに役立ちます。無菌の外科用ドレープ (動物の向きを示すために透明) を麻酔した動物の上に置いて、無菌性を維持します。(B)後腹膜筋膜(緑色のボックス)は、大動脈の前方に覆われています。(C)後腹膜筋膜の解剖後の腎下大動脈の例。IVCからの大動脈の分離は、大動脈と左腎静脈が前方に交差するときのちょうど遠位に位置するIVCとの間の潜在的な空間から開始することによって達成することができる(黄色の円)。略語:IVC =下大静脈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 腎下大動脈の円周解剖と分離:IVCと腎下大動脈が全見えであることを確認します。最初に後腹膜(RP)筋膜に入って分割することにより、大動脈の露出を開始します(図2B)。前腎下大動脈に沿って平行に走る性腺(精巣または卵巣)動脈を特定します(図2B および 図3)。鉗子を使用して、筋膜を性腺動脈間で鈍く分割し、縦方向に続けて大動脈を前方に露出させます(図2C)。注:RP筋膜は、リンパ管と内臓神経叢を含む結合組織の薄くて半透明の層です。大動脈を露出させるためには、RP筋膜を通して解剖する必要があります。ただし、大動脈外膜の結合組織を通して解剖しないでください。.外膜(白い結合組織)の裂け目は媒体を露出させ(真っ赤に見えます)、エラスターゼが適用されると、大動脈はこの部位で破裂する可能性があります。 次に、IVCから腹部大動脈を分離し始めます。この解剖は、IVCと大動脈の間の小さな隙間から開始し、大動脈を横切る左腎静脈の下端のすぐ下にあります(図2C)。鉗子の先端を使用して、大動脈とIVCの間の結合組織繊維を穏やかに広げ、このレベルで大動脈の周りを円周方向に働き続けます。注:IVCは非常に薄肉で、繊維状結合組織の細かい層によって大動脈に密着しています。IVCの取り扱いやIVCのクリーニングは極力避けるように注意してください。最初にIVCから大動脈の右側を解剖すると(周囲の筋肉組織から大動脈の左側を解剖する前に)、大動脈がIVCから「離れる」のに役立ちます。 大動脈とIVCの間の平面を単刀直入に解剖し続け、大動脈分岐部に向かって尾側に働きかけます。大動脈分岐部に到達したら、それ以上の遠位解離を停止します。注:通常、腎下大動脈の中央部近くに位置し、IVCを横切って横方向に移動する下腸間膜動脈(IMA)の周囲を解剖する場合は、特に注意してください。 大動脈の右端がIVCから分離したら、左腎静脈のレベルまで近位に戻ります。.大動脈の左端の外側からRP筋膜を解剖し、大動脈が完全に分離されるまで円周方向に働きかけます。後腹膜解離の関連する解剖学については、 図3 を参照してください。注:腰椎静脈と動脈の位置と数に大きなばらつきがあるため、大動脈の後ろを解剖することに注意してください。この解剖による出血のリスクが高い領域の参照については、 図4 を参照してください。 大動脈がIVCおよび周囲の筋肉組織から可能な限り円周方向に分離されていることを注意深く検査し、IMAと腰動脈によってつながれた大動脈セグメントの周りを慎重に解剖します。. 図5Aに示すように、大動脈の右端と左端に沿って手袋のストリップを置きます。IVCをできるだけ多くカバーするようにしてください。 ハンドヘルドノギスを使用して、最も広い大動脈径を測定し、3つの測定値を記録します。測定の前後に、キャリパーの先端に70%EtOHをスプレーします。汚染を防ぐために、大動脈をキャリパーの先端に直接接触させないでください。注意: キャリブレーションされたカメラ対応顕微鏡を使用した写真も利用できます。 図3:マウスの下腹部、骨盤、および後腹膜への血液供給の解剖学的構造。 略語:R =右;L =左。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:後腹膜解離および腎下大動脈の円周的隔離中に損傷および出血のリスクが高い部位。 略語:L =左;IMA = 下腸間膜動脈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:エラスターゼ/BAPNマウスAAAモデル中のエラスターゼの適用または偽物に対する術中の反応 (A) 大動脈をエラスターゼに浸したまま、IVCと腸をエラスターゼへの曝露から保護するために、エラスターゼの適用前に大動脈の長さに沿って手袋のセグメントが配置されます (B) 変性エララスターゼの適用は大動脈の拡張を引き起こさない (青いボックス)。最大大動脈径はベースラインで 0.627 mm を測定し、5 分間の局所変性エラスターゼ後に 0.607 mm を測定しました。(C)エラスターゼの適用は、治療の5分後に大動脈拡張を引き起こします。この例では、大動脈(緑)が0.607 mmから0.953 mmに拡張し、直径が57%増加しました。略語:BAPN = ß-アミノプロピオニトリル;AAA = 腹部大動脈瘤。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 エラスターゼアプリケーション:綿の先端の綿棒を使用して、大動脈から余分な血液や体液を軽くたたきます。 次に、大動脈の上に10mm×2mmの乾燥ガーゼを置きます。ピペットを使用して5μLのエラスターゼ(または変性エラスターゼを制御)を分注し、ガーゼと大動脈を飽和させます。手袋の部分を大動脈の周りにそっと折ります。注:偽グループまたは対照グループで使用するための変性エラスターゼを調製するには、エラスターゼを100°Cで30分間煮沸します。 エラスターゼが大動脈に作用するまで5分間待ちます。この潜伏期間中、必要に応じて、腹部ロールと皮膚リトラクターによって置かれた緊張の一部を解放します。注: エラスターゼのバッチ効果により、研究者は、特定の研究内のすべての実験に同じボトルのエラスターゼを使用することをお勧めします。エラスターゼの新しいボトルごとに、(4週間前)早期破裂の圧倒的な数がないことを確認するために、用量反応を実行することをお勧めします。.エラスターゼの塗布時間は、エラスターゼへの反応に応じて4〜6分の間で調整することもできます。 5分後、腸の収縮をリセットし、手袋の部分を広げます。1 mLの温かい0.9%滅菌生理食塩水で腹腔を洗浄し、大動脈からガーゼと手袋片を慎重に取り除きます。.腹部の生理食塩水を10 cm x 10 cmのガーゼで吸収します。腹部の洗浄を合計3 x 3 mL繰り返します。 ハンドヘルドキャリパーを使用して、エラスターゼ適用後の最も広い大動脈径を再測定し、3倍を記録します。偽および活性型エラスターゼによる治療への大動脈拡張の例については、 図5B、C を参照してください。注:エラスターゼの前後の3つの測定値の平均を使用して、治療による大動脈径の変化率を計算できます。通常、エラスターゼ処理の直後には30~50%の顕著な拡張が見られ、これはエラスターゼが機能し、大動脈が適切に治療されたことを確認するのに役立ちます。大動脈の直径は、変性エラスターゼの適用によって変化しないか、わずかに小さく測定される場合があります(おそらくけいれんから)。. 腹腔の閉鎖:腹部ロールを腸の下から体外に慎重に取り外します。必要に応じて、除去中に腹部のロールにくっつかないように、腸に追加の生理食塩水を適用します。.腸がピンク色に見え、適切に灌流されていることを確認してください。注:腸を元の位置に戻す必要はありません。そうしようとすると、腸のねじれや内ヘルニアのリスクがあります。 実行中の5-0非吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して腹部筋膜を再近似します。3〜4個のスキンステープルでスキンを閉じます。 6. 術後の動物のケア マウスをヒートランプ付きのリカバリーケージに入れます。ケージの温度が熱くなく、暖かくなっていることを確認してください。 0.9%生理食塩水の0.5〜1mLの皮下液ボーラスを投与します。. マウスが施設のプロトコルに従って活動するまで、温めたケージ内で ~20 分間自然に回復させた後、ハウジングケージに戻ります。 施設のプロトコルに従って、術後 1 日目の手術後 24 時間でカルプロフェン 20 mg/kg を投与し、毎日 3 日間継続します。 7. 大動脈測定と組織採取 イソフルランと子宮頸部脱臼による安楽死に続いて、腹腔を再開します。胸骨を通して切開部を伸ばして胸部にアクセスします。右心房を切除し、左心室に10mLの冷たい1%DPBS溶液を2分間かけて灌流します。.肺、肝臓、脾臓を切除します。注:腸を傷つけないように注意してください。腸内容物のこぼれは、組織分析に影響を与える可能性があります。 腹部大動脈を露出させ、上記のように腎下大動脈の最大直径を測定します。大動脈全体と心臓を解剖し続けます。心臓と大動脈が分離されたら、すべての動脈枝と総腸骨動脈を切断し、大動脈の短いセグメントを無傷のままにします。心臓と大動脈を、定規と画像の隣の対照的な背景に置きます。 8. データ分析とレポーティング 人為的ミスを考慮するために、ハンドヘルドノギスを使用する場合は、大動脈の直径をそれぞれ少なくとも3倍測定し、その直径を平均値として報告します。 AAAは、健康な大動脈径が50%増加すると定義します。研究結果には、総大動脈直径と直径の変化率の両方を必ず含めてください。