Summary

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

Published: May 03, 2024
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Summary

この研究では、新しい κ-カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液浴を導入し、顕著な可逆的なジャミング-アンジャミング遷移特性を示します。これらの特性は、埋め込まれた3Dバイオプリンティングにおける生体模倣組織や臓器の構築に貢献しています。心臓/食道様組織の高解像度と細胞増殖によるプリンティングの成功は、高品質のバイオプリンティングおよび組織工学の応用を示しています。

Abstract

粒状ヒドロゲル支持浴を利用した埋め込み型三次元(3D)バイオプリンティングは、生体模倣スキャフォールドを作成するための重要な技術として浮上しています。しかし、正確なバイオインクの沈着と細胞の生存率および機能のバランスをとる適切なゲル懸濁液培地を設計するには、特に望ましい粘弾性特性を達成する上で複数の課題があります。ここでは、新しい κ-カラギーナンゲル支持浴が、操作が容易な機械的粉砕プロセスを通じて製造され、均質なサブマイクロスケールの粒子を生成します。これらのサブマイクロゲルは、小さな降伏応力と急速なせん断減粘特性を備えた典型的なビンガム流動挙動を示し、バイオインクのスムーズな堆積を促進します。さらに、 κ-カラギーナンマイクロゲルネットワークの可逆的なゲルゾル転移と自己修復能力により、プリントされたコンストラクトの構造的完全性が確保され、明確な建築的特徴を持つ複雑な多層組織構造の作成が可能になります。プリント後、 κ-カラギーナンサブマイクロゲルは、単純なリン酸緩衝生理食塩水洗浄で簡単に除去できます。さらに、細胞を多く含むバイオインクを用いたバイオプリンティングにより、バイオミメティックコンストラクト内の細胞は92%という高い生存率を持ち、偽足を急速に伸ばし、堅固な増殖を維持することが実証されており、このバイオプリンティング戦略が組織や臓器の作製に応用できる可能性が示されています。要約すると、この新しい κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地は、優れた品質の埋め込みバイオプリンティングの有望な手段として浮上しており、人工組織や臓器の in vitro 開発に深い意味を持っています。

Introduction

電気紡糸繊維、多孔質スポンジ、高分子ハイドロゲルなどの組織工学足場は、細胞増殖、組織再生、臓器機能の回復を支える構造的枠組みを提供することにより、損傷した組織や臓器の修復と再建において極めて重要な役割を果たします1,2,3.しかし、従来のスキャフォールドでは、天然の組織構造を正確に再現するという課題に直面し、人工組織と天然組織との間にミスマッチが生じます。この制限は、欠陥のある組織の効率的な治癒を妨げ、より正確なバイオミミクリーを達成するための足場設計の進歩が緊急に必要であることを強調しています。3次元(3D)バイオプリンティングは、生体材料のインクと細胞4を使用して、複雑な生体組織構造を層ごとに正確に構築する革新的な製造技術です。さまざまな生体材料の中で、高分子ハイドロゲルは、細胞のin situカプセル化を促進し、細胞の成長を決定的にサポートする独特のネットワークを備えた理想的なバイオインクとして浮上しています5,6。それにもかかわらず、多くの柔らかく高水和したハイドロゲルは、バイオインクとして使用すると、印刷プロセス中に印刷された足場構造のぼやけや急速な崩壊を誘発する傾向があります。この課題に対処するために、組み込み型3Dバイオプリンティング技術は、マイクロゲル浴を支持材料として採用し、正確なソフトバイオインクの堆積を可能にしました。ハイドロゲルバイオインクをゲル化すると、マイクロゲル浴を取り外すことにより、複雑な構造を持つ精製されたバイオニックスキャフォールドが得られます。ゼラチン7,8、アガロース9、ジェランガム10,11などの材料は、埋め込み型3Dバイオプリンティング用のマイクロゲルバスの作成に使用されており、組織工学におけるソフトハイドロゲルの応用を大幅に進めています。しかし、これらの粒子状ゲルのミクロンレベルで不均一な粒子サイズは、3Dプリンティング12,13,14の解像度と忠実度に悪影響を及ぼします。小さく均一に分散した粒子を持つゲル状の懸濁液フロートを作製することが急務であり、高忠実度のバイオプリンティングを実現する上での利点があります。

このプロトコルでは、均一なサブミクロンレベルの新しい犠牲顆粒 κ-カラギーナン懸濁槽が埋め込まれた3Dプリンティングのために提示されます。この革新的なサブマイクロゲル浴の急速なジャミング-アンジャミング遷移の挙動は、高い構造忠実度15の生体模倣ヒドロゲル足場の正確な製造を容易にする。この新しい懸濁液媒体を利用して、ゼラチンメタクリレートとシルクファイバーメタクリレートで構成される複合バイオインクを使用して、多層組織構造を特徴とする一連の生体模倣組織および臓器構築物が成功裏に印刷されます。この研究では、食道が多層組織構造を持っているだけでなく、その筋肉層も内部の円形および外部の縦方向の複雑な層構造を示すことを主な理由として、食道を3Dバイオプリンティングバイオミメティックオブジェクトとして選択しました。これらの層の適切な配置と組織化を確保することは、機能的な組織の再生に不可欠です。したがって、食道の多層構造を再現することを強く望んでいます。さらに重要なことに、 κ-カラギーナンサブマイクロゲルを懸濁液浴として、GelMA/SFMAをバイオインクとして利用し、組織工学のための生体模倣足場を設計および構築しました。印刷された食道は、リン酸緩衝生理食塩水洗浄を繰り返すことで簡単に放出できます。さらに、 κ-カラギーナンサブマイクロゲル浴は細胞毒性物質を含まないため、高い細胞適合性が保証されます15。異方性足場内にロードされた平滑筋細胞は、顕著な拡散活動を示します。この均一なサブマイクロゲル懸濁液は、埋め込まれた3Dバイオプリンティングを通じて複雑な組織や臓器を作製するための新しい道を提供します。

Protocol

1. κ -カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液浴の調製 1,000 mLのガラス瓶内の500 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)溶液に1.75 gのκ-カラギーナン粉末を加えて、500 mLのκ-カラギーナン懸濁液浴(0.35%重量/vol)を調製します。 70 mmのマグネチックスターラーバーをガラス瓶に導入して、水性混合物を攪拌します。ガラス瓶のキャップを締めてから、半?…

Representative Results

粒状κ-カラギーナンゲル浴は、バルクハイドロゲルを機械的に分解して粒子状ゲルスラリーにすることによって生成されました。最新の研究では、κ-カラギーナン粒子は、機械的混合15の1000rpmで均一な形態を有する約642±65nmの平均直径を示し、これは以前に文献で報告されたマイクロゲルの寸法よりも有意に小さいことを実証した16,17,18</s…

Discussion

バイオプリンティングで使用する κカラギーナンサブマイクロゲル懸濁液浴の調製は、得られた培地がバイオインクを支えるための望ましい特性を示すことを保証するためのいくつかの重要なステップを含む、慎重に調整されたプロセスです。最初に、 κカラギーナン溶液は、 κカラギーナン粉末を高温で脱イオン水に溶解するこ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、寧波自然科学財団(2022J121、2023J159)、寧波市自然科学財団の主要プロジェクト(2021J256)、復旦大学(復旦大学)の国家高分子工学研究所のオープン財団(K2024-35)、および中国浙江省のアテローム性動脈硬化症の精密医療の主要研究所(2022E10026)の支援を受けました。寧波大学健康科学センターのコア施設による技術サポートに感謝します。

Materials

3D bioprinter Custom-designed
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole Solarbio Life Science C0065 Ready-to-use
405 nm UV light EFL XY-WJ01
Cell Counter Corning Cyto smart 6749
Confocal laser scanning microscope Leica STELLARIS 5
DMEM high glucose VivaCell C3113-0500 High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine
Dynamic rotational rheometer TA Instrument Discovery HR-20
Esophageal smooth muscle cells Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University Primary cells from the rabbit esophagus
Fetal bovine serum UE F9070L
Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin Solarbio Life Science CA1610 300T
Gelatin methacrylate EFL EFL-GM-60 60% substitution
k-carrageenan Aladdin C121013-100g Reagent grade
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate Aladdin L157759-1g 365~405 nm
Live-Dead kit beyotime C2015M
Microplate reader Potenov PT-3502B
Paraformaldehyde Solarbio Life Science P1110  4%
Penicillin/streptomycin Solarbio Life Science MA0110 100 ´
Phosphate buffered saline VivaCell C3580-0500 pH 7.2-7.4
Silk fibroin methacrylate EFL EFL-SilMA-001 39% substitution
Triton X-100 Solarbio Life Science T8200
Trypsin-EDTA VivaCell C100C1 0.25%, without phenol red

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Cite This Article
Zhang, H., Zhu, T., Luo, Y., Xu, R., Li, G., Hu, Z., Cao, X., Yao, J., Chen, Y., Zhu, Y., Wu, K. Embedded Bioprinting of Tissue-like Structures Using κ-Carrageenan Sub-Microgel Medium. J. Vis. Exp. (207), e66806, doi:10.3791/66806 (2024).

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