הדפסה ביולוגית משובצת של מבנים דמויי רקמות באמצעות מדיום תת-מיקרוג'ל κ-Carrageenan
Summary
מחקר זה מציג אמבט תרחיף תת-מיקרוג’ל κ-carrageenan חדשני, המציג תכונות מעבר הפיכות מדהימות של שיבוש וביטול חסימה. תכונות אלה תורמות לבניית רקמות ואיברים ביומימטיים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית משובצת. ההדפסה המוצלחת של רקמות דמויות לב/ושט עם רזולוציה גבוהה וצמיחת תאים מדגימה יישומים באיכות גבוהה של הדפסה ביולוגית והנדסת רקמות.
Abstract
הדפסה ביולוגית תלת-ממדית (תלת-ממדית) משובצת באמצעות אמבט תומך הידרוג’ל גרעיני התפתחה כטכניקה קריטית ליצירת פיגומים ביומימטיים. עם זאת, הנדסה של מדיום מתלה ג’ל מתאים המאזן בין שקיעת ביו-דיו מדויקת לבין כדאיות התא ותפקודו מציבה אתגרים רבים, במיוחד בהשגת התכונות הויסקו-אלסטיות הרצויות. כאן, ג’ל κ-קרגינן חדשני התומך באמבטיה מיוצר באמצעות תהליך טחינה מכני קל לתפעול, המייצר חלקיקים הומוגניים תת-מיקרוסקולריים. תת-מיקרו-ג’לים אלה מפגינים התנהגות זרימה טיפוסית של בינגהאם עם לחץ תפוקה קטן ותכונות של דילול גזירה מהיר, המאפשרות שיקוע חלק של ביו-דיו. יתר על כן, המעבר ההפיך של ג’ל-סול ויכולות הריפוי העצמי של רשת מיקרו-ג’ל κ-carrageenan מבטיחים את השלמות המבנית של מבנים מודפסים, ומאפשרים יצירת מבני רקמות מורכבים ורב-שכבתיים עם מאפיינים אדריכליים מוגדרים. לאחר ההדפסה, ניתן להסיר בקלות את תת-המיקרו-ג’לים κ-carrageenan באמצעות שטיפת מלח פשוטה עם מאגר פוספטים. הדפסה ביולוגית נוספת עם דיו ביולוגי עמוס תאים מראה כי תאים בתוך מבנים ביומימטיים יש כדאיות גבוהה של 92% ולהרחיב במהירות pseudopodia, כמו גם לשמור על שגשוג חזק, דבר המצביע על הפוטנציאל של אסטרטגיית הדפסה ביולוגית זו לייצור רקמות ואיברים. לסיכום, מדיום תת-מיקרוג’ל κ-קרגינן חדשני זה מתגלה כאפיק מבטיח להדפסה ביולוגית משובצת באיכות יוצאת דופן, הנושא השלכות עמוקות על התפתחות במבחנה של רקמות ואיברים מהונדסים.
Introduction
פיגומים להנדסת רקמות, כולל סיבים אלקטרו-סובבים, ספוגים נקבוביים והידרוג’לים פולימריים, ממלאים תפקיד מרכזי בתיקון ושחזור של רקמות ואיברים פגומים על ידי מתן מסגרת מבנית התומכת בצמיחת תאים, התחדשות רקמות ושיקום תפקוד איברים 1,2,3. עם זאת, פיגומים מסורתיים נתקלים באתגרים בשכפול מדויק של מבני רקמות מקומיים, מה שמוביל לחוסר התאמה בין הרקמות המהונדסות והטבעיות. מגבלה זו מעכבת ריפוי יעיל של רקמות פגומות, ומדגישה את הצורך הדחוף בהתקדמות בעיצוב פיגומים כדי להשיג ביומימיקרי מדויק יותר. הדפסה ביולוגית תלת מימדית (3D) היא טכניקת ייצור חדשנית הבונה במדויק מבנים מורכבים של רקמות ביולוגיות שכבה אחר שכבה באמצעות דיו ביו-חומרי ותאים4. בין ביו-חומרים שונים, הידרוג’לים פולימריים מתגלים כביו-דיו אידיאליים עם הרשת הייחודית שלהם המאפשרת אנקפסולציה באתרם של תאים ותומכת באופן מכריע בצמיחתם 5,6. עם זאת, הידרוג’לים רכים ורוויי לחות רבים נוטים לגרום לטשטוש או לקריסה מהירה של מבני פיגומים מודפסים במהלך תהליך ההדפסה, כאשר הם משמשים כדיו ביולוגי. כדי להתמודד עם אתגר זה, טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית משובצת משתמשת באמבט מיקרוג’ל כחומר תמיכה, המאפשר שיקוע מדויק של דיו ביו-דיו רך. עם ג’לציה של bioinks הידרוג’ל, פיגומים ביוניים מזוקקים עם מבנים מורכבים מתקבלים על ידי הסרת אמבט מיקרוג’ל. חומרים כמו ג’לטין 7,8, אגרוז9 וגלן גאם10,11 שימשו ליצירת אמבטיות מיקרוג’ל להדפסה ביולוגית תלת-ממדית משובצת, מה שמקדם משמעותית את היישום של הידרוג’לים רכים בהנדסת רקמות. עם זאת, גודל החלקיקים ברמת מיקרון ולא אחיד של ג’לים חלקיקיים אלה משפיע לרעה על הרזולוציה והנאמנות של הדפסת תלת ממד 12,13,14. יש צורך דחוף לייצר תרחיף דמוי ג’ל עם חלקיקים קטנים ומפוזרים באופן אחיד, המציע יתרונות בהשגת הדפסה ביולוגית באיכות גבוהה.
בפרוטוקול זה, אמבט תרחיף κ-carrageenan גרגירי חדשני עם רמת תת-מיקרון אחידה מוצג להדפסה תלת-ממדית משובצת. התנהגות אמבטיה תת-מיקרוג’לית חדשנית זו של מעבר מהיר לשיבוש ושחרור חסימה מאפשרת ייצור מדויק של פיגומי הידרוג’ל ביומימטיים עם נאמנות מבנית גבוהה15. תוך שימוש בתווך ההשעיה החדש הזה, סדרה של מבני רקמות ואיברים ביומימטיים הכוללים מבני רקמות רב-שכבתיים מודפסים בהצלחה, תוך שימוש בביו-דיו מרוכב המורכב מג’לטין מתקרילט ומשי פיברו מתקרילט. במחקר זה, בחרנו בוושט כאובייקט הביומימטי התלת-ממדי המודפס ביולוגית, בעיקר משום שהוושט הוא לא רק בעל מבנה רקמתי רב-שכבתי, אלא גם שכבת השריר שלו מציגה מבנה שכבות מורכב פנימי מעגלי ואורכי חיצוני. הבטחת יישור וארגון נאותים של שכבות אלה חיונית להתחדשות רקמות תפקודית. לכן, אנו רוצים מאוד לשכפל את הארכיטקטורה הרב-שכבתית של הוושט. חשוב מכך, השתמשנו בתת-מיקרו-ג’לים κ-carrageenan כאמבט תרחיף וב-GelMA/SFMA כביו-דיו כדי לתכנן ולבנות פיגום ביומימטי להנדסת רקמות. הוושט המודפס יכול להשתחרר בקלות על ידי שטיפה חוזרת ונשנית של מי מלח חוצצים בפוספט. יתר על כן, אמבט κ-carrageenan sub-microgel הוא ללא חומרים ציטוטוקסיים, הבטחת cytocompatibility גבוהה15. תאי השריר החלק העמוסים בתוך פיגומים אנאיזוטרופיים מפגינים פעילות התפשטות בולטת. מדיום תרחיף תת-מיקרוג’ל אחיד זה מציע דרך חדשה לייצור רקמות ואיברים מורכבים באמצעות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית משובצת.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכנת אמבטיות תרחיף תת-מיקרוג’ל κ-carrageenan לשימוש בהדפסה ביולוגית היא תהליך מתוזמר בקפידה הכולל מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח שהמדיום המתקבל יציג את התכונות הרצויות לתמיכה בדיו ביולוגי. בתחילה, פתרון κ-carrageenan מוכן על ידי המסת אבקת κ-carrageenan במים deionized בטמפר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן נינגבו למדעי הטבע (2022J121, 2023J159), פרויקט מפתח של הקרן למדעי הטבע של העיר נינגבו (2021J256), הקרן הפתוחה של מעבדת מפתח המדינה להנדסה מולקולרית של פולימרים (אוניברסיטת פודאן) (K2024-35), ומעבדת מפתח לרפואה מדויקת למחלות טרשת עורקים במחוז ג’ג’יאנג, סין (2022E10026). תודה על התמיכה הטכנית על ידי מתקני הליבה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת נינגבו.
Materials
| 3D bioprinter | Custom-designed | ||
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole | Solarbio Life Science | C0065 | Ready-to-use |
| 405 nm UV light | EFL | XY-WJ01 | |
| Cell Counter | Corning | Cyto smart 6749 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | STELLARIS 5 | |
| DMEM high glucose | VivaCell | C3113-0500 | High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine |
| Dynamic rotational rheometer | TA Instrument | Discovery HR-20 | |
| Esophageal smooth muscle cells | Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University | Primary cells from the rabbit esophagus | |
| Fetal bovine serum | UE | F9070L | |
| Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin | Solarbio Life Science | CA1610 | 300T |
| Gelatin methacrylate | EFL | EFL-GM-60 | 60% substitution |
| k-carrageenan | Aladdin | C121013-100g | Reagent grade |
| Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate | Aladdin | L157759-1g | 365~405 nm |
| Live-Dead kit | beyotime | C2015M | |
| Microplate reader | Potenov | PT-3502B | |
| Paraformaldehyde | Solarbio Life Science | P1110 | 4% |
| Penicillin/streptomycin | Solarbio Life Science | MA0110 | 100 ´ |
| Phosphate buffered saline | VivaCell | C3580-0500 | pH 7.2-7.4 |
| Silk fibroin methacrylate | EFL | EFL-SilMA-001 | 39% substitution |
| Triton X-100 | Solarbio Life Science | T8200 | |
| Trypsin-EDTA | VivaCell | C100C1 | 0.25%, without phenol red |
References
- Xu, X., et al. Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration. J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).
- Amann, E., et al. A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells. Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692 (2021).
- Afjoul, H., et al. Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study. Mater Sci Eng C. 113, 110957 (2020).
- Hasanzadeh, R., et al. Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing. Chem Eng J. 476, 146616 (2023).
- Fu, L., et al. Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement. Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).
- Bertsch, P., et al. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758 (2015).
- Wang, S., et al. 3d bioprinting of neurovascular tissue modeling with collagen-based low-viscosity composites. Adv Healthcare Mater. 12 (25), e2300004 (2023).
- Sreepadmanabh, M., et al. Jammed microgel growth medium prepared by flash-solidification of agarose for 3d cell culture and 3d bioprinting. Biomed Mater. 18 (4), 045011 (2023).
- Zeng, J., et al. Comparative analysis of the residues of granular support bath materials on printed structures in embedded extrusion printing. Biofabrication. 15 (3), 035013 (2023).
- Terpstra, M. L., et al. Bioink with cartilage-derived extracellular matrix microfibers enables spatial control of vascular capillary formation in bioprinted constructs. Biofabrication. 14 (3), 034104 (2022).
- Compaan, A. M., et al. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Appl Mater Inter. 11 (6), 5714-5726 (2019).
- Compaan, A. M., Song, K., Chai, W., Huang, Y. Cross-linkable microgel composite matrix bath for embedded bioprinting of perfusable tissue constructs and sculpting of solid objects. ACS Appl Mater Inter. 12 (7), 7855-7868 (2020).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910573 (2020).
- Zhang, H., et al. Cation-crosslinked κ-carrageenan sub-microgel medium for high-quality embedded bioprinting. Biofabrication. 16, 025009 (2024).
- Lee, A., et al. 3d bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- Yao, J., et al. Slightly photo-crosslinked chitosan/silk fibroin hydrogel adhesives with hemostasis and anti-inflammation for pro-healing cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Mater Today Bio. 25, 100947 (2024).
- Senior, J. J., et al. Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting. J Vis Exp. (195), e64458 (2023).
- Roche, C. D., et al. durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels. Front Bioeng Biotech. 9, 63657 (2021).
- Wang, D., et al. Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels. Sci Adv. 8 (43), (2022).
- Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues. Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).
