الطباعة الحيوية المضمنة للهياكل الشبيهة بالأنسجة باستخدام وسط κ-Carrageenan Sub-Microgel
Summary
تقدم هذه الدراسة حماما معلقا جديدا للميكروجيل κ-carrageenan ، يعرض خصائص انتقالية رائعة للتشويش وفك التشويش عكسيا. تساهم هذه السمات في بناء أنسجة وأعضاء المحاكاة الحيوية في الطباعة الحيوية 3D المضمنة. توضح الطباعة الناجحة للأنسجة الشبيهة بالقلب / المريء بدقة عالية ونمو الخلايا تطبيقات الطباعة الحيوية وهندسة الأنسجة عالية الجودة.
Abstract
ظهرت الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد (3D) المضمنة باستخدام حمام دعم هيدروجيل حبيبي كتقنية حاسمة لإنشاء سقالات محاكاة حيوية. ومع ذلك ، فإن هندسة وسط تعليق جل مناسب يوازن بين الترسيب الدقيق للحبر الحيوي وصلاحية الخلية ووظيفتها يمثل تحديات متعددة ، لا سيما في تحقيق الخصائص اللزجة المرنة المطلوبة. هنا ، يتم تصنيع حمام دعم هلام κ-carrageenan جديد من خلال عملية طحن ميكانيكية سهلة التشغيل ، مما ينتج عنه جزيئات متجانسة دون المجهرية. تظهر هذه الهلاميات شبه الهلامية سلوك تدفق بينغهام النموذجي مع إجهاد صغير في الغلة وخصائص ترقق القص السريع ، مما يسهل الترسيب السلس للأحبار الحيوية. علاوة على ذلك ، يضمن انتقال الجل القابل للانعكاس وقدرات الشفاء الذاتي لشبكة κ-carrageenan microgel السلامة الهيكلية للتركيبات المطبوعة ، مما يتيح إنشاء هياكل أنسجة معقدة متعددة الطبقات مع ميزات معمارية محددة. بعد الطباعة ، يمكن إزالة الهلاميات الفرعية κ-carrageenan بسهولة عن طريق غسل ملحي بسيط مخزن بالفوسفات. توضح الطباعة الحيوية الإضافية باستخدام الأحبار الحيوية المحملة بالخلايا أن الخلايا داخل تركيبات المحاكاة الحيوية تتمتع بقدرة عالية على البقاء بنسبة 92٪ وتمتد بسرعة إلى pseudopodia ، بالإضافة إلى الحفاظ على انتشار قوي ، مما يشير إلى إمكانات استراتيجية الطباعة الحيوية هذه لتصنيع الأنسجة والأعضاء. باختصار ، يبرز هذا الوسيط شبه الدقيق κ-carrageenan الجديد كوسيلة واعدة للطباعة الحيوية المدمجة بجودة استثنائية ، مما يحمل آثارا عميقة على التطوير في المختبر للأنسجة والأعضاء المهندسة.
Introduction
تلعب سقالات هندسة الأنسجة ، بما في ذلك الألياف المغزولة بالكهرباء والإسفنج المسامي والهلاميات المائية البوليمرية ، دورا محوريا في إصلاح وإعادة بناء الأنسجة والأعضاء التالفة من خلال توفير إطار هيكلي يدعم نمو الخلايا وتجديد الأنسجة واستعادة وظيفة الأعضاء1،2،3. ومع ذلك ، تواجه السقالات التقليدية تحديات في تكرار هياكل الأنسجة الأصلية بدقة ، مما يؤدي إلى عدم تطابق بين الأنسجة الهندسية والطبيعية. يعيق هذا القيد الشفاء الفعال للأنسجة المعيبة ، مما يؤكد الحاجة الملحة لتطورات تصميم السقالة لتحقيق تقليد حيوي أكثر دقة. الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد (3D) هي تقنية تصنيع مبتكرة تبني بدقة هياكل الأنسجة البيولوجية المعقدة طبقة تلو الأخرى باستخدام أحبار وخلايا المواد الحيوية4. من بين المواد الحيوية المختلفة ، تظهر الهلاميات المائية البوليمرية كأحبار حيوية مثالية بشبكتها المميزة التي تسهل تغليف الخلايا في الموقع وتدعم نموها بشكل حاسم 5,6. ومع ذلك ، تميل العديد من الهلاميات المائية اللينة وعالية الرطوبة إلى إحداث ضبابية أو انهيار سريع لهياكل السقالات المطبوعة أثناء عملية الطباعة عند استخدامها كأحبار حيوية. لمواجهة هذا التحدي ، تستخدم تقنية الطباعة الحيوية 3D المضمنة حمام ميكروجيل كمواد داعمة ، مما يسمح بترسب دقيق للحبر الحيوي الناعم. عند هلام الأحبار الحيوية الهيدروجيل ، يتم الحصول على سقالات إلكترونية مكررة ذات هياكل معقدة عن طريق إزالة حمام microgel. تم استخدام مواد مثل الجيلاتين7،8 ، والأغاروز9 ، وصمغ جيلان10،11 لإنشاء حمامات ميكروجيل للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد المدمجة ، مما أدى إلى تقدم كبير في تطبيق الهلاميات المائية اللينة في هندسة الأنسجة. ومع ذلك ، فإن حجم الجسيمات على مستوى الميكرون وغير المنتظم لهذه المواد الهلامية للجسيمات يؤثر بشكل ضار على دقة ودقة الطباعة ثلاثية الأبعاد12،13،14. هناك حاجة ملحة لتصنيع عوامة تعليق تشبه الهلام مع جزيئات صغيرة ومشتتة بشكل موحد ، مما يوفر مزايا في تحقيق طباعة حيوية عالية الدقة.
في هذا البروتوكول ، يتم تقديم حمام تعليق حبيبي جديد κ-carrageenan مع مستوى شبه ميكرون موحد للطباعة 3D المضمنة. يسهل سلوك الحمام المبتكر شبه الميكروجيل هذا للانتقال السريع للتشويش والتشويش التصنيع الدقيق لسقالات هيدروجيل المحاكية بيولوجيا بدقة هيكليةعالية 15. باستخدام وسيط التعليق الجديد هذا ، تتم طباعة سلسلة من تركيبات الأنسجة والأعضاء المحاكية بيولوجيا التي تتميز بهياكل أنسجة متعددة الطبقات بنجاح ، باستخدام حبر حيوي مركب يتكون من ميثاكريلات الجيلاتين والميثاكريلات الليفي الحرير. في هذه الدراسة ، اخترنا المريء ككائن محاكاة حيوية للطباعة الحيوية 3D بشكل أساسي لأن المريء لا يحتوي فقط على بنية أنسجة متعددة الطبقات ولكن أيضا طبقة عضلاته تعرض بنية طبقات معقدة دائرية وخارجية طولية. يعد ضمان المحاذاة والتنظيم المناسبين لهذه الطبقات أمرا ضروريا لتجديد الأنسجة الوظيفية. لذلك ، نرغب بشدة في تكرار البنية متعددة الطبقات للمريء. والأهم من ذلك ، استخدمنا الميكروهلاميات الفرعية κ-carrageenan كحمام معلق و GelMA / SFMA كحبر حيوي لتصميم وبناء سقالة محاكاة حيوية لهندسة الأنسجة. يمكن إطلاق المريء المطبوع بسهولة عن طريق الغسيل الملحي المتكرر المخزن بالفوسفات. علاوة على ذلك ، فإن حمام κ-carrageenan sub-microgel خال من المواد السامة للخلايا ، مما يضمن التوافق الخلويالعالي 15. تظهر خلايا العضلات الملساء المحملة داخل سقالات متباينة الخواص نشاطا ملحوظا للانتشار. يوفر وسيط التعليق شبه الدقيق الموحد هذا وسيلة جديدة لتصنيع الأنسجة والأعضاء المعقدة من خلال الطباعة الحيوية 3D المدمجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد تحضير حمامات تعليق κ-carrageenan sub-microgel للاستخدام في الطباعة الحيوية عملية منسقة بعناية تتضمن عدة خطوات حاسمة لضمان أن الوسط الناتج يعرض الخصائص المطلوبة لدعم الأحبار الحيوية. في البداية ، يتم تحضير محلول κ-carrageenan عن طريق إذابة مسحوق κ-carrageenan في الماء م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة نينغبو للعلوم الطبيعية (2022J121 ، 2023J159) ، والمشروع الرئيسي لمؤسسة العلوم الطبيعية في مدينة نينغبو (2021J256) ، والأساس المفتوح لمختبر الدولة الرئيسي للهندسة الجزيئية للبوليمرات (جامعة فودان) (K2024-35) ، والمختبر الرئيسي للطب الدقيق لأمراض تصلب الشرايين في مقاطعة تشجيانغ ، الصين (2022E10026). شكرا للدعم الفني من قبل المرافق الأساسية ، مركز العلوم الصحية بجامعة نينغبو.
Materials
| 3D bioprinter | Custom-designed | ||
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole | Solarbio Life Science | C0065 | Ready-to-use |
| 405 nm UV light | EFL | XY-WJ01 | |
| Cell Counter | Corning | Cyto smart 6749 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | STELLARIS 5 | |
| DMEM high glucose | VivaCell | C3113-0500 | High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine |
| Dynamic rotational rheometer | TA Instrument | Discovery HR-20 | |
| Esophageal smooth muscle cells | Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University | Primary cells from the rabbit esophagus | |
| Fetal bovine serum | UE | F9070L | |
| Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin | Solarbio Life Science | CA1610 | 300T |
| Gelatin methacrylate | EFL | EFL-GM-60 | 60% substitution |
| k-carrageenan | Aladdin | C121013-100g | Reagent grade |
| Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate | Aladdin | L157759-1g | 365~405 nm |
| Live-Dead kit | beyotime | C2015M | |
| Microplate reader | Potenov | PT-3502B | |
| Paraformaldehyde | Solarbio Life Science | P1110 | 4% |
| Penicillin/streptomycin | Solarbio Life Science | MA0110 | 100 ´ |
| Phosphate buffered saline | VivaCell | C3580-0500 | pH 7.2-7.4 |
| Silk fibroin methacrylate | EFL | EFL-SilMA-001 | 39% substitution |
| Triton X-100 | Solarbio Life Science | T8200 | |
| Trypsin-EDTA | VivaCell | C100C1 | 0.25%, without phenol red |
References
- Xu, X., et al. Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration. J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).
- Amann, E., et al. A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells. Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692 (2021).
- Afjoul, H., et al. Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study. Mater Sci Eng C. 113, 110957 (2020).
- Hasanzadeh, R., et al. Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing. Chem Eng J. 476, 146616 (2023).
- Fu, L., et al. Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement. Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).
- Bertsch, P., et al. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758 (2015).
- Wang, S., et al. 3d bioprinting of neurovascular tissue modeling with collagen-based low-viscosity composites. Adv Healthcare Mater. 12 (25), e2300004 (2023).
- Sreepadmanabh, M., et al. Jammed microgel growth medium prepared by flash-solidification of agarose for 3d cell culture and 3d bioprinting. Biomed Mater. 18 (4), 045011 (2023).
- Zeng, J., et al. Comparative analysis of the residues of granular support bath materials on printed structures in embedded extrusion printing. Biofabrication. 15 (3), 035013 (2023).
- Terpstra, M. L., et al. Bioink with cartilage-derived extracellular matrix microfibers enables spatial control of vascular capillary formation in bioprinted constructs. Biofabrication. 14 (3), 034104 (2022).
- Compaan, A. M., et al. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Appl Mater Inter. 11 (6), 5714-5726 (2019).
- Compaan, A. M., Song, K., Chai, W., Huang, Y. Cross-linkable microgel composite matrix bath for embedded bioprinting of perfusable tissue constructs and sculpting of solid objects. ACS Appl Mater Inter. 12 (7), 7855-7868 (2020).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910573 (2020).
- Zhang, H., et al. Cation-crosslinked κ-carrageenan sub-microgel medium for high-quality embedded bioprinting. Biofabrication. 16, 025009 (2024).
- Lee, A., et al. 3d bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- Yao, J., et al. Slightly photo-crosslinked chitosan/silk fibroin hydrogel adhesives with hemostasis and anti-inflammation for pro-healing cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Mater Today Bio. 25, 100947 (2024).
- Senior, J. J., et al. Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting. J Vis Exp. (195), e64458 (2023).
- Roche, C. D., et al. durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels. Front Bioeng Biotech. 9, 63657 (2021).
- Wang, D., et al. Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels. Sci Adv. 8 (43), (2022).
- Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues. Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).
