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Biochemistry

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리)

Published: May 03, 2024
doi:
10.3791/66771
,
1Department of Biochemistry,University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems,University of Zaragoza

Summary

이 프로토콜은 소량의 샘플만 사용할 수 있는 경우 호흡기 초복합체를 분석하는 기술을 설명합니다.

Abstract

지난 수십 년 동안 호흡기 초복합체(SC)의 존재에 대해 축적된 증거는 미토콘드리아 전자 수송 사슬 조직에 대한 우리의 이해를 변화시켰고, 이는 “가소성 모델”의 제안을 낳았습니다. 이 모델은 조직 또는 세포 대사 상태에 따라 서로 다른 비율의 SC와 복합체가 공존한다고 가정합니다. SC에서 조립의 동적 특성으로 인해 셀은 사용 가능한 연료의 사용과 전자 전달의 효율성을 최적화하여 활성 산소 종 생성을 최소화하고 셀이 환경 변화에 적응할 수 있는 능력을 선호할 수 있습니다.

최근에는 신경퇴행성 질환(알츠하이머병, 파킨슨병), 바스 증후군(Barth Syndrome), 리 증후군(Leigh syndrome), 암(cancer) 등 다양한 질환에서 SC 조립의 이상이 보고되고 있다. 질병 진행에서 SC 어셈블리 변경의 역할은 아직 확인되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 SC 어셈블리 상태를 결정하기에 충분한 양의 샘플을 사용할 수 있는지는 종종 어려운 과제입니다. 이는 크기가 작거나 여러 분석을 위해 나누어야 하는 생검 또는 조직 샘플, 성장이 느리거나 미세유체 장치에서 추출한 세포 배양, 일부 1차 배양 또는 희귀 세포 또는 특정 고가의 처리(나노 입자, 매우 비싼 화합물 등)의 효과를 분석해야 하는 경우에 발생합니다. 이러한 경우 효율적이고 적용하기 쉬운 방법이 필요합니다. 이 논문은 소량의 세포 또는 조직에서 농축된 미토콘드리아 분획을 얻는 데 적합한 방법을 제시하여 기본 전기영동으로 미토콘드리아 SC의 구조와 기능을 분석한 후 겔 내 활성 분석 또는 웨스턴 블롯을 수행합니다.

Introduction

초복합체(SC)는 개별 호흡 사슬 복합체 1,2 사이의 초분자 결합입니다. SC의 초기 식별과 Schägger 2,3 그룹에 의한 그 구성에 대한 설명 이후, 나중에 다른 그룹에 의해 확인된 이래, SC는 서로 다른 화학량론에서 호흡기 복합체 I, III 및 IV(CI, CIII 및 CIV)를 포함하고 있음이 확인되었습니다. SC의 두 가지 주요 집단을 정의할 수 있는데, CI(및 CIII 단독 또는 CIII 및 CIV)를 포함하고 분자량이 매우 높은(MW, 더 작은 SC의 경우 ~1.5MDa부터 시작: CI + CIII2) 및 CIII 및 CIV를 포함하지만 CI는 포함하지 않고 훨씬 더 작은 크기(예: ~680kDa의 CIII2 + CIV). 이러한 SC는 내부 미토콘드리아 막에 유리 복합체와 공존하며 비율도 다릅니다. 따라서, CI는 대부분 관련 형태에서 발견되지만(즉, SCs에서: 소의 심장에서 ~80%, 많은 인간 세포 유형에서 90% 이상)3, CIV는 자유 형태(소의 심장에서 80% 이상)에서 매우 풍부하며, CIII는 보다 균형 잡힌 분포를 보여줍니다(더 풍부한 자유 형태의 경우 ~40%, Dimer로, in bovine heart).

그들의 존재는 현재 일반적으로 받아들여지고 있지만, 그들의 정확한 역할은 여전히 논쟁 중이다 4,5,6,7,8,9,10. 가소성 모델에 따르면, 세포 유형 또는 대사 상태에 따라 SC와 개별 복합체의 비율이 상이하게 존재할 수 있다 1,7,11. 조립체의 이러한 역동적 인 특성으로 인해 셀은 사용 가능한 연료의 사용과 환경 변화에 대응하여 산화 인산화 (OXPHOS) 시스템의 효율성을 조절 할 수 있습니다 4,5,7. SC는 또한 활성 산소 종 생성 속도를 제어하고 개별 복합체 4,12,13,14의 안정화 및 회전율에 참여할 수 있습니다. SC 조립 상태의 수정은 다양한 생리학적 및 병리학적 상황(15,16) 및 노화 과정(17)과 관련하여 설명되었다.

따라서, SC 패턴의변화는 성장에 사용되는 탄소원에 따라 효모에서 설명되었으며2, 포도당이 갈락토스4로 치환될 때 배양된 포유류 세포에서 설명되었습니다. 또한 공복 후 생쥐의 간에서변화가 보고되었으며8 미토콘드리아 지방산 산화가 차단된 성상세포(astrocyte)에서도 변화가 보고되었다18. 또한, 바스 증후군(Barth syndrome)19, 심부전(heart failure)20, 여러 대사 장애(multiple metabolic21) 및 신경학적장애(neurological 22,23,24), 그리고 다른 종양(25,26,27,28)에서 SC와 OXPHOS의 감소 또는 변화가 발견되었다. SC 조립 및 수준의 이러한 변화가 이러한 병리학적 상황에서 주요 원인인지 또는 2차 효과를 나타내는지 여부는 아직 조사 중입니다15,16. 다양한 방법론이 SC의 조립 및 기능에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 여기에는 활성 측정 8,29, 초구조 분석(30,31) 및 단백질체학(32,33)이 포함됩니다. 점점 더 많이 채택되고 있으며 앞서 언급한 방법론 중 일부의 시작점이 되는 유용한 대안은 Schägger의 그룹34,35에서 이 목적을 위해 개발한 블루 네이티브(BN) 전기영동에 의한 SC 조립 상태의 직접 측정입니다.

이 접근법은 미토콘드리아 막을 얻고 용해시키기 위해 재현 가능하고 효율적인 절차가 필요하며 겔 내 활성 분석(IGA), 2차원 전기영동 및 웨스턴 블롯(WB)과 같은 다른 기술로 보완할 수 있습니다. BN 전기영동에 의한 SC 동역학 연구의 한계는 시작 세포 또는 조직 샘플의 양일 수 있습니다. SC 조립 및 기능 분석을 위한 일련의 프로토콜은 Schägger의 그룹 분석법에서 채택되었으며, 20mg의 조직부터 시작하여 신선 또는 냉동 세포 또는 조직 샘플에 적용할 수 있습니다.

Protocol

참고: 모든 배양 배지 및 완충액의 조성은 표 1 에 명시되어 있으며 이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 시약과 관련된 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다. 1. 세포 배양에서 미토콘드리아 분리 참고: 분석된 세포의 최소 부피는 ~30-50μL의 충전된 세포입니다(1.4단계). 이는 세포 유형(L929 유래 세포에서 5 × 106</…

Representative Results

위에서 설명한 프로토콜에 따라 얻어진 미토콘드리아의 수율은 세포주 또는 조직 유형, 샘플의 특성(즉, 신선 또는 냉동 조직이 사용되는 경우) 또는 균질화 공정의 효율성과 같은 여러 요인에 따라 달라집니다. 다른 세포주와 조직에서 얻은 미토콘드리아의 예상 수율은 표 2에 수집되어 있습니다. 미토콘드리아 분획이 얻어지면 다음 단계는 호흡기 SC 패턴 분석으로, BN-PAGE에 의한 미?…

Discussion

여기에 설명된 프로토콜에 도입된 방법론적 조정은 미토콘드리아 복합 활성(충분한 양의 샘플의 가용성이 저하될 때 중요함)을 유지하고 조직 또는 세포주의 예상되는 SC 패턴을 재현하면서 손실을 피하고 수율을 높이기 위한 것입니다( 그림 2C 참조).). 이러한 목적으로 SC를 제대로 검출하는 데 높은 미토콘드리아 순도가 필요하지 않기 때문에 가능할 때마다 단계 수, 시간 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 https://ciencia.sede.gob.es/(Ministerio de Ciencia e Innovación)의 보조금 번호 “PGC2018-095795-B-I00″과 https://www.aragon.es/(Diputación General de Aragón)의 보조금 “Grupo de Referencia: E35_17R” 및 보조금 번호 “LMP220_21″를 통해 PF-S 및 RM-L에 지원되었습니다.

Materials

Acetic acid PanReac 131008
Aminocaproic acid Fluka Analytical 7260
ATP Sigma-Aldrich A2383
Bis Tris Acrons Organics 327721000
Bradford assay Biorad 5000002
Coomassie Blue G-250 Serva 17524
Coomassie Blue R-250 Merck 1125530025
Cytochrome c Sigma-Aldrich C2506
Diamino  benzidine (DAB) Sigma-Aldrich D5637
Digitonin Sigma-Aldrich D5628
EDTA PanReac 131669
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Fatty acids free BSA Roche 10775835001
Glycine PanReac A1067
Homogenizer Teflon pestle Deltalab 196102
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
K2HPO4 PanReac 121512
KH2PO4 PanReac 121509
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
Methanol Labkem MTOL-P0P
MgSO4 PanReac 131404
Mini Trans-Blot Cell BioRad 1703930
MOPS Sigma-Aldrich M1254
MTCO1 Monoclonal Antibody Invitrogen 459600
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NADH Roche 10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels Invitrogen BN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x) Invitrogen BN2002
NativePAGE Running Buffer (20x)  Invitrogen BN2001
NDUFA9 Monoclonal Antibody Invitrogen 459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT) Sigma-Aldrich N6876
Pb(NO3)2 Sigma-Aldrich 228621
PDVF Membrane Amersham 10600023
Phenazine methasulfate (PMS) Sigma-Aldrich P9625
Pierce ECL Substrate Thermo Scientific 32106
PMSF Merck PMSF-RO
SDHA Monoclonal Antibody Invitrogen 459200
Sodium succinate Sigma-Aldrich S2378
Streptomycin/penicillin PAN biotech P06-07100
Sucrose Sigma-Aldrich S3089
Tris PanReac A2264
UQCRC1 Monoclonal Antibody Invitrogen 459140
XCell SureLock Mini-Cell Invitrogen  EI0001
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References

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Mitochondrial SupercomplexesRespiratory Chain ComplexesMitochondrial IsolationMitochondrial FractionationCell Culture SamplesNative ElectrophoresisIn-gel Activity AssaysWestern Blot

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Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples . J. Vis. Exp. (207), e66771, doi:10.3791/66771 (2024).
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