Un enfoque eficiente de transgénesis para la entrega de genes en el corazón embrionario de ratón
Summary
Este protocolo presenta un marco metodológico detallado para la transgénesis de células cardíacas basada en electroporación en corazones de ratón en desarrollo. Los recursos de video que se proporcionan aquí facilitarán el aprendizaje de esta técnica versátil.
Abstract
El corazón de los mamíferos es un órgano complejo que se forma durante el desarrollo a través de poblaciones muy diversas de células progenitoras. El origen, el momento del reclutamiento y el destino de estos progenitores son vitales para el correcto desarrollo de este órgano. Los mecanismos moleculares que gobiernan la morfogénesis del corazón son esenciales para comprender la patogenia de las cardiopatías congénitas y la regeneración cardíaca embrionaria. Los enfoques clásicos para investigar estos mecanismos emplearon la generación de ratones transgénicos para evaluar la función de genes específicos durante el desarrollo cardíaco. Sin embargo, la transgénesis del ratón es un proceso complejo y lento que a menudo no se puede realizar para evaluar el papel de genes específicos durante el desarrollo del corazón. Para abordar esto, hemos desarrollado un protocolo para la electroporación eficiente y el cultivo de corazones embrionarios de ratón, lo que permite que la transgénesis transitoria evalúe rápidamente el efecto de la ganancia o pérdida de función de los genes involucrados en el desarrollo cardíaco. Utilizando esta metodología, sobreexpresamos con éxito Meis1 en el corazón embrionario, con preferencia por la transfección de células epicárdicas, demostrando las capacidades de la técnica.
Introduction
El corazón es el primer órgano que se forma durante el desarrollo embrionario. Este proceso implica la coordinación espacio-temporal de varias poblaciones de células progenitoras de distintas áreas del embrión. Todo esto ocurre mientras el corazón en desarrollo continúa latiendo y funcionando, enfatizando la notable coordinación requerida para su formación 1,2,3. Dado el papel crucial del corazón, una regulación estricta a nivel celular y molecular es esencial para su correcta formación 4,5. La identificación de los mecanismos que controlan el desarrollo del corazón ha sido de gran interés, ya que son cruciales para desentrañar los trastornos cardíacos congénitos, que afectan a un número sustancial de pacientes en todo el mundo6. Además, comprender el desarrollo del corazón es fundamental para descifrar la regeneración cardíaca, ya que el corazón de los mamíferos postnatales conserva una capacidad regenerativa que se pierde o se ve obstaculizada en la edad adulta 7,8. En consecuencia, la disección de los reguladores moleculares del desarrollo cardíaco es imprescindible para avanzar en los esfuerzos de investigación sobre las cardiopatías congénitas y la regeneración cardíaca.
En la búsqueda de este objetivo, ha habido un creciente enfoque en la investigación del papel del epicardio en el desarrollo y la regeneración cardíaca9. El epicardio es una capa delgada de tejido mesotelial que comprende la capa más externa del corazón de los mamíferos (Figura 1). Estudios recientes han demostrado la importancia del epicardio durante la lesión cardíaca, revelando que este tejido es capaz de enviar señales de proliferación a los cardiomiocitos en el área afectada para mitigar el daño 10,11. A pesar de la importancia del epicardio, la realización de nuevas investigaciones moleculares se ha visto dificultada por su inmensa heterogeneidad. Los experimentos de RNAseq de una sola célula han revelado la heterogeneidad del epicardio, que alberga múltiples subpoblaciones celulares con firmas transcriptómicas distintas 12,13,14,15,16. Por lo tanto, una estrategia para detectar posibles reguladores del desarrollo cardíaco debería acomodar la diversidad de células progenitoras epicárdicas.
En este sentido, la susceptibilidad del modelo murino a la modificación genética ha facilitado la identificación de numerosos genes cruciales para el desarrollo del corazón, permitiendo la generación de líneas mutantes con ganancia de función (GOF) o pérdida de función (LOF) de genes específicos. Sin embargo, estos enfoques implican una inversión considerable de tiempo y recursos experimentales; Por lo tanto, son poco prácticos a la hora de evaluar las funciones de un gran número de genes candidatos. Además, los genes del desarrollo a menudo ejercen funciones pleiotrópicas en diferentes tejidos o son necesarios para el desarrollo embrionario temprano, lo que dificulta la interpretación de su contribución al desarrollo en un proceso específico. Si bien es posible dirigirse a la función génica en estructuras específicas o puntos temporales del desarrollo, esto generalmente requiere el uso de construcciones genéticas más complejas, que pueden ser difíciles de generar o que generalmente no están disponibles.
Para superar estas limitaciones, presentamos una metodología para electroporatar corazones embrionarios de ratón para la transgénesis transitoria (Figura 2). Junto con el cultivo ex vivo y la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), esta estrategia demuestra sus capacidades a través del GOF transitorio de Meis1, un gen bien caracterizado implicado en el desarrollo y la regeneración del corazón 17,18,19. En este artículo también se exploran otras posibles aplicaciones de esta metodología, y se discuten sus ventajas y limitaciones, así como se comparan con los protocolos existentes para la modulación transitoria de la expresión génica. Creemos que el marco y los ejemplos visuales presentados mejorarán la comprensión de la biología del epicardio durante el desarrollo y la enfermedad.
Figura 1: Capas de corazón embrionario de ratón. Diagrama esquemático de una vista coronal de un corazón embrionario de ratón E13-14. Las tres capas celulares principales del corazón están representadas en amarillo (endocardio), rojo (miocardio) y azul (epicardio). El pericardio está representado en una línea marrón. Las cuatro cavidades del corazón se abrevian como VI, ventrículo izquierdo; VD: ventrículo derecho; LA, aurícula izquierda; AR: aurícula derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resumen esquemático del protocolo de electroporación cardíaca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
En general, la metodología descrita aquí ofrece un marco robusto para expresar constructos transgénicos en el epicardio en desarrollo (Figura 4B), como lo demuestra la sobreexpresión de Meis1 (Figura 4C). Con los constructos apropiados, este protocolo se puede utilizar para evaluar transitoriamente el impacto de la ganancia de función (GOF) o la pérdida de función (LOF) de un gen específico. El LOF se puede implementar en la técnica mediante la transfec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio ha sido financiado por la subvención RTI2018-097617-J-I00 del Ministerio de Ciencia e Innovación y Acción 9 de la Universidad de Jaén a la O.H.O. La subvención PGC2018-096486-B-I00 del Ministerio de Ciencia e Innovación y la subvención H2020-MSCA-ITN-2016-722427 del programa Horizonte 2020 de la UE al M.T. JMG contó con el apoyo de una beca de doctorado del Ministerio de Ciencia de España y la Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Tanto el CNIC como el CBMSO cuentan con el apoyo del Ministerio de Ciencia español, y el CNIC cuenta con el apoyo de la Fundación ProCNIC.
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate | BD Falcon | 353043 | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 40 µm Cell Strainer | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | CLS431751 | |
| Anti-GFP Policlonal Antibody | Invitrogen | A10262 | 1:1000 dilution used |
| Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody | Invitrogen | 14-6503-82 | 1:500 dilution used |
| CD1 Wild Type mice | Provided by Animalary Unit (CNIC) | ||
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signalling Technologies | 9661 | 1:400 dilution used |
| DAPI | Cell Signalling Technologies | 4083 | 1:1000 dilution used |
| Dispase/collagenase | Roche | 10269638001 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51032720 | |
| Leica Stereoscopic Microscope S8AP0 | Leica | 11524102 | |
| Liberase | Roche | 5401119001 | |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
| pCAG expression plasmid | Addgene | #89689 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dishes 35 × 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Petri dishes 60 × 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
| Phenol Red | Merck | P3532 | |
| Pipette tips | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody | Abcam | ab89901 | 1:300 dilution used |
| Square Wave Electroporator CUY21SC | Nepa Gene | CUY664-10X15 | |
| Sterile PBS | Provided and autoclaved by technical unit | ||
| Sucrose | Millipore | 84100 | |
| Tweezer electrodes with variable gap | Nepa Gene | CUY650P5 |
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