Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos
Summary
Este protocolo apresenta uma estrutura metodológica detalhada para a transgênese baseada em eletroporação de células cardíacas em corações de camundongos em desenvolvimento. Os recursos de vídeo fornecidos aqui facilitarão o aprendizado dessa técnica versátil.
Abstract
O coração de mamíferos é um órgão complexo formado durante o desenvolvimento por meio de populações altamente diversas de células progenitoras. A origem, o momento do recrutamento e o destino desses progenitores são vitais para o desenvolvimento adequado desse órgão. Os mecanismos moleculares que governam a morfogênese do coração são essenciais para a compreensão da patogênese das cardiopatias congênitas e da regeneração cardíaca embrionária. Abordagens clássicas para investigar esses mecanismos empregaram a geração de camundongos transgênicos para avaliar a função de genes específicos durante o desenvolvimento cardíaco. No entanto, a transgênese de camundongos é um processo complexo e demorado que muitas vezes não pode ser realizado para avaliar o papel de genes específicos durante o desenvolvimento do coração. Para resolver isso, desenvolvemos um protocolo para eletroporação e cultura eficientes de corações embrionários de camundongos, permitindo que a transgênese transitória avalie rapidamente o efeito do ganho ou perda de função de genes envolvidos no desenvolvimento cardíaco. Usando essa metodologia, superexpressamos com sucesso Meis1 no coração embrionário, com preferência pela transfecção de células epicárdicas, demonstrando as capacidades da técnica.
Introduction
O coração é o primeiro órgão formado durante o desenvolvimento embrionário. Este processo envolve a coordenação espaço-temporal de várias populações de células progenitoras de áreas distintas do embrião. Tudo isso ocorre enquanto o coração em desenvolvimento continua batendo e funcionando, enfatizando a notável coordenação necessária para sua formação 1,2,3. Dado o papel crucial do coração, a regulação rigorosa nos níveis celular e molecular é essencial para sua formação adequada 4,5. Identificar os mecanismos que controlam o desenvolvimento cardíaco tem sido de grande interesse, pois são cruciais para desvendar as cardiopatias congênitas, que afetam um número substancial de pacientes em todo omundo6. Além disso, compreender o desenvolvimento cardíaco é fundamental para decifrar a regeneração cardíaca, pois os corações de mamíferos pós-natais retêm uma capacidade regenerativa que é perdida ou prejudicada na idade adulta 7,8. Consequentemente, dissecar os reguladores moleculares do desenvolvimento do coração é imperativo para avançar nos esforços de pesquisa sobre doenças cardíacas congênitas e regeneração cardíaca.
Em busca desse objetivo, tem havido um foco crescente na investigação do papel do epicárdio no desenvolvimento e regeneração cardíaca9. O epicárdio é uma fina camada de tecido mesotelial que compreende a camada mais externa do coração dos mamíferos (Figura 1). Estudos recentes têm mostrado a importância do epicárdio durante a lesão cardíaca, revelando que esse tecido é capaz de enviar sinais de proliferação aos cardiomiócitos na área afetada para mitigar o dano 10,11. Apesar da importância do epicárdio, a realização de novas investigações moleculares tem sido desafiada por sua imensa heterogeneidade. Experimentos de RNAseq de célula única revelaram a heterogeneidade do epicárdio, abrigando múltiplas subpopulações celulares com assinaturas transcriptômicas distintas 12,13,14,15,16. Assim, uma estratégia para rastrear potenciais reguladores do desenvolvimento cardíaco deve acomodar a diversidade de células progenitoras epicárdicas.
Nesse sentido, a receptividade do modelo de camundongo à modificação genética facilitou a identificação de inúmeros genes cruciais para o desenvolvimento do coração, permitindo a geração de linhagens mutantes com ganho de função (GOF) ou perda de função (LOF) de genes específicos. No entanto, essas abordagens implicam um investimento considerável de tempo e recursos experimentais; portanto, eles são impraticáveis ao avaliar os papéis de um grande número de genes candidatos. Além disso, os genes de desenvolvimento frequentemente exercem funções pleiotrópicas em diferentes tecidos ou são necessários para o desenvolvimento embrionário inicial, dificultando a interpretação de sua contribuição para o desenvolvimento em um processo específico. Embora seja possível direcionar a função do gene em estruturas específicas ou pontos de tempo de desenvolvimento, isso geralmente requer o uso de construções genéticas mais complexas, que podem ser difíceis de gerar ou geralmente não estão disponíveis.
Para superar essas limitações, apresentamos uma metodologia para eletroporar corações embrionários de camundongos para transgênese transitória (Figura 2). Emparelhada com cultura ex vivo e classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), essa estratégia demonstra suas capacidades por meio do GOF transitório de Meis1, um gene bem caracterizado implicado no desenvolvimento e regeneração do coração 17,18,19. Neste artigo, outras aplicações potenciais desta metodologia também são exploradas, e suas vantagens e limitações são discutidas, bem como comparadas aos protocolos existentes para modulação transitória da expressão gênica. Acreditamos que a estrutura e os exemplos visuais apresentados aumentarão a compreensão da biologia do epicárdio durante o desenvolvimento e a doença.
Figura 1: Camadas do coração embrionário de camundongo. Diagrama esquemático de uma visão coronal de um coração embrionário de camundongo E13-14. As três principais camadas celulares do coração são representadas em amarelo (endocárdio), vermelho (miocárdio) e azul (epicárdio). O pericárdio é representado em uma linha marrom. As quatro câmaras do coração são abreviadas como VE, ventrículo esquerdo; VD, ventrículo direito; AE, átrio esquerdo; AD, átrio direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral esquemática do protocolo de eletroporação cardíaca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
No geral, a metodologia descrita aqui oferece uma estrutura robusta para expressar construções transgênicas no epicárdio em desenvolvimento (Figura 4B), conforme demonstrado pela superexpressão de Meis1 (Figura 4C). Com as construções apropriadas, este protocolo pode ser usado para avaliar transitoriamente o impacto do ganho de função (GOF) ou perda de função (LOF) de um gene específico. O LOF pode ser implementado na técnica transfectando um plasm?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado pela bolsa RTI2018-097617-J-I00 do Ministério de Ciência e Inovação da Espanha e Acción 9 da Universidad de Jaén para O.H.O. Concessão PGC2018-096486-B-I00 do Ministério de Ciência e Inovação da Espanha e bolsa H2020-MSCA-ITN-2016-722427 do programa Horizonte 2020 da UE para M.T. JMG foi apoiado por uma bolsa de doutorado do Ministério da Ciência da Espanha e da Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Tanto o CNIC quanto o CBMSO são apoiados pelo Ministério da Ciência da Espanha, e o CNIC é apoiado pela Fundação ProCNIC.
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate | BD Falcon | 353043 | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 40 µm Cell Strainer | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | CLS431751 | |
| Anti-GFP Policlonal Antibody | Invitrogen | A10262 | 1:1000 dilution used |
| Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody | Invitrogen | 14-6503-82 | 1:500 dilution used |
| CD1 Wild Type mice | Provided by Animalary Unit (CNIC) | ||
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signalling Technologies | 9661 | 1:400 dilution used |
| DAPI | Cell Signalling Technologies | 4083 | 1:1000 dilution used |
| Dispase/collagenase | Roche | 10269638001 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51032720 | |
| Leica Stereoscopic Microscope S8AP0 | Leica | 11524102 | |
| Liberase | Roche | 5401119001 | |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
| pCAG expression plasmid | Addgene | #89689 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dishes 35 × 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Petri dishes 60 × 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
| Phenol Red | Merck | P3532 | |
| Pipette tips | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody | Abcam | ab89901 | 1:300 dilution used |
| Square Wave Electroporator CUY21SC | Nepa Gene | CUY664-10X15 | |
| Sterile PBS | Provided and autoclaved by technical unit | ||
| Sucrose | Millipore | 84100 | |
| Tweezer electrodes with variable gap | Nepa Gene | CUY650P5 |
References
- Tyser, R. C., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, e17113 (2016).
- Tyser, R. C. V., et al. Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium. Science. 371 (6533), eabb2986 (2021).
- Sendra, M., Domínguez, J., Torres, M., Ocaña, O. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5 (2021).
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, e30668 (2017).
- Ai, D., et al. Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth. PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).
- Zimmerman, M. S., et al. Global, regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Cao, J., Poss, K. D. The epicardium as a hub for heart regeneration. Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PLOS One. 7 (9), e44692 (2012).
- Hesse, J., et al. Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart. eLife. 10, e65921 (2021).
- Streef, T. J., Smits, A. M. Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium. Front Cardiovasc Med. 8, 750243 (2021).
- Sanchez-Fernandez, C., et al. Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration. J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376 (2023).
- Quijada, P., et al. Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium. Nat Commun. 12 (1), 4155 (2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nat Commun. 12 (1), 1771 (2021).
- Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration. Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).
- Stankunas, K., et al. Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease. Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).
- Liu, Y., et al. Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice. J Adv Res. 39, 275-289 (2022).
- Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2014).
- Wong, M. D., et al. 4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging. Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).
- Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
- Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet. Muscle. 5 (1), 22 (2015).
- Eissa, N., et al. Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis. PLOS One. 11 (5), e0156289 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA. Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).
- Carmona, R., Barrena, S., López Gambero, A. J., Rojas, A., Muñoz-Chápuli, R. Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium. FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).
- Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. Peer J. 9, e11165 (2021).
- Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications. JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart. J Vis Exp. 75, e50359 (2013).
