גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר
Summary
פרוטוקול זה מציג מסגרת מתודולוגית מפורטת לטרנסגנזה מבוססת אלקטרופורציה של תאי לב בהתפתחות לבבות עכברים. נכסי הווידאו המסופקים כאן יקלו על למידה של טכניקה רב-תכליתית זו.
Abstract
לב היונקים הוא איבר מורכב שנוצר במהלך ההתפתחות באמצעות אוכלוסיות מגוונות מאוד של תאי אב. מקורם, עיתוי גיוסם וגורלם של אבות אלה חיוניים להתפתחותו התקינה של איבר זה. המנגנונים המולקולריים השולטים במורפוגנזה של הלב חיוניים להבנת הפתוגנזה של מחלות לב מולדות והתחדשות לב עוברית. גישות קלאסיות לחקר מנגנונים אלה השתמשו ביצירת עכברים טרנסגניים כדי להעריך את תפקודם של גנים ספציפיים במהלך התפתחות הלב. עם זאת, טרנסגנזה של עכברים היא תהליך מורכב, גוזל זמן שלעתים קרובות לא ניתן לבצע כדי להעריך את תפקידם של גנים ספציפיים במהלך התפתחות הלב. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו פרוטוקול לאלקטרופורציה יעילה ולתרבית של לבבות עובריים של עכברים, המאפשר טרנסגנזה חולפת להעריך במהירות את ההשפעה של רווח או אובדן תפקוד של גנים המעורבים בהתפתחות הלב. באמצעות מתודולוגיה זו, ביטאנו בהצלחה את Meis1 בלב העוברי, עם העדפה להתמרה של תאים אפיקרדיאליים, תוך הדגמת יכולות הטכניקה.
Introduction
הלב הוא האיבר הראשון שנוצר במהלך ההתפתחות העוברית. תהליך זה כרוך בתיאום מרחבי-זמני של אוכלוסיות שונות של תאי אב מאזורים שונים של העובר. כל זה קורה בזמן שהלב המתפתח ממשיך לפעום ולתפקד, תוך הדגשת הקואורדינציה יוצאת הדופן הנדרשת להיווצרותו 1,2,3. בהתחשב בתפקיד המכריע של הלב, ויסות הדוק ברמה התאית והמולקולרית חיוני להיווצרותו התקינה 4,5. זיהוי המנגנונים השולטים בהתפתחות הלב מעורר עניין רב, שכן הם חיוניים לפענוח הפרעות לב מולדות, המשפיעות על מספר ניכר של חולים ברחבי העולם6. יתר על כן, הבנת התפתחות הלב היא חיונית בפענוח התחדשות הלב, שכן לבבות יונקים לאחר לידה שומרים על יכולת התחדשות שאובדת או מעוכבת בבגרות 7,8. כתוצאה מכך, ניתוח הרגולטורים המולקולריים של התפתחות הלב הוא הכרחי כדי לקדם את מאמצי המחקר על מחלות לב מולדות והתחדשות לב.
במרדף אחר מטרה זו, יש התמקדות הולכת וגוברת בחקירת תפקידו של האפיקרדיום בהתפתחות הלבוהתחדשות 9. האפיקרדיום הוא שכבה דקה של רקמה מזותלית שמהווה את השכבה החיצונית ביותר של לב היונקים (איור 1). מחקרים אחרונים הראו את חשיבותו של אפיקרדיום במהלך פגיעה לבבית, וחשפו כי רקמה זו מסוגלת לשלוח אותות התפשטות לקרדיומיוציטים באזור הפגוע כדי למתן את הנזק10,11. למרות חשיבותו של אפיקרדיום, ביצוע חקירות מולקולריות נוספות אותגר על ידי ההטרוגניות העצומה שלו. ניסויי RNAseq חד-תאיים חשפו את ההטרוגניות של האפיקרדיום, המאכלס תת-אוכלוסיות תאים מרובות עם חתימות שעתוק ברורות 12,13,14,15,16. לפיכך, אסטרטגיה לסינון רגולטורים פוטנציאליים של התפתחות הלב צריכה להתאים למגוון תאי האב האפיקרדיאליים.
במובן זה, ההתאמה של מודל העכבר לשינוי גנטי הקלה על זיהוי גנים רבים החיוניים להתפתחות הלב, ואפשרה יצירת קווים מוטנטיים עם רווח של תפקוד (GOF) או אובדן תפקוד (LOF) של גנים ספציפיים. עם זאת, גישות אלה מרמזות על השקעה ניכרת של זמן ומשאבים ניסיוניים; לכן, הם אינם מעשיים בעת הערכת תפקידיהם של מספר רב של גנים מועמדים. מלבד זאת, גנים התפתחותיים לעיתים קרובות מפעילים פונקציות פליוטרופיות ברקמות שונות או נדרשים להתפתחות עוברית מוקדמת, מה שפוגע בפרשנות תרומתם להתפתחות בתהליך מסוים. בעוד שניתן לכוון את תפקוד הגנים במבנים ספציפיים או בנקודות זמן התפתחותיות, זה בדרך כלל דורש שימוש במבנים גנטיים מורכבים יותר, אשר יכולים להיות קשים ליצירה או שאינם זמינים בדרך כלל.
כדי להתגבר על המגבלות האלה, אנו מציגים מתודולוגיה לאלקטרופורציה של לבבות עובריים של עכברים עבור טרנסגנזה חולפת (איור 2). בשילוב עם תרבית ex vivo ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS), אסטרטגיה זו מדגימה את יכולותיה באמצעות GOF חולף של Meis1, גן מאופיין היטב המעורב בהתפתחות לבוהתחדשות 17,18,19. במאמר זה נחקרים גם יישומים פוטנציאליים אחרים של מתודולוגיה זו, ונדונים יתרונותיה ומגבלותיה, וכן בהשוואה לפרוטוקולים קיימים לוויסות זמני של ביטוי גנים. אנו מאמינים שהמסגרת והדוגמאות החזותיות שהוצגו ישפרו את ההבנה של ביולוגיה של אפיקרדיום במהלך התפתחות ומחלות.
איור 1: שכבות לב עובריות של עכברים. תרשים סכמטי של תצוגה קורונלית של לב עוברי עכבר E13-14. שלוש השכבות התאיות העיקריות של הלב מיוצגות בצהוב (אנדוקרדיום), אדום (שריר הלב) וכחול (אפיקרדיום). קרום הלב מיוצג בקו חום. ארבעת חדרי הלב מקוצרים כ-LV, החדר השמאלי; RV, החדר הימני; לוס אנג’לס, אטריום שמאלי; RA, אטריום ימני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סקירה סכמטית של פרוטוקול אלקטרופורציה של הלב. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
באופן כללי, המתודולוגיה המתוארת כאן מציעה מסגרת איתנה לביטוי מבנים טרנסגניים באפיקרדיום המתפתח (איור 4B), כפי שמודגם על-ידי ביטוי יתר של Meis1 (איור 4C). עם המבנים המתאימים, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך באופן זמני את ההשפעה של רווח של תפקוד (GOF) או אובדן תפקוד (L…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק RTI2018-097617-J-I00 מ- Ministerio de Ciencia e Innovación הספרדי ו- Acción 9 מאוניברסיטת חאאן ל- O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 מה- Ministerio de Ciencia e Innovación הספרדי ומענק H2020-MSCA-ITN-2016-722427 מתוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי ל- M.T. JMG נתמך על ידי מלגת דוקטורט ממשרד המדע הספרדי וקרן Severo Ochoa (PRE2022-101884). הן CNIC והן CBMSO נתמכים על ידי משרד המדע הספרדי, וה- CNIC נתמך על ידי קרן ProCNIC.
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate | BD Falcon | 353043 | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 40 µm Cell Strainer | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | CLS431751 | |
| Anti-GFP Policlonal Antibody | Invitrogen | A10262 | 1:1000 dilution used |
| Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody | Invitrogen | 14-6503-82 | 1:500 dilution used |
| CD1 Wild Type mice | Provided by Animalary Unit (CNIC) | ||
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signalling Technologies | 9661 | 1:400 dilution used |
| DAPI | Cell Signalling Technologies | 4083 | 1:1000 dilution used |
| Dispase/collagenase | Roche | 10269638001 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51032720 | |
| Leica Stereoscopic Microscope S8AP0 | Leica | 11524102 | |
| Liberase | Roche | 5401119001 | |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
| pCAG expression plasmid | Addgene | #89689 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dishes 35 × 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Petri dishes 60 × 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
| Phenol Red | Merck | P3532 | |
| Pipette tips | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody | Abcam | ab89901 | 1:300 dilution used |
| Square Wave Electroporator CUY21SC | Nepa Gene | CUY664-10X15 | |
| Sterile PBS | Provided and autoclaved by technical unit | ||
| Sucrose | Millipore | 84100 | |
| Tweezer electrodes with variable gap | Nepa Gene | CUY650P5 |
References
- Tyser, R. C., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, e17113 (2016).
- Tyser, R. C. V., et al. Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium. Science. 371 (6533), eabb2986 (2021).
- Sendra, M., Domínguez, J., Torres, M., Ocaña, O. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5 (2021).
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, e30668 (2017).
- Ai, D., et al. Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth. PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).
- Zimmerman, M. S., et al. Global, regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Cao, J., Poss, K. D. The epicardium as a hub for heart regeneration. Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PLOS One. 7 (9), e44692 (2012).
- Hesse, J., et al. Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart. eLife. 10, e65921 (2021).
- Streef, T. J., Smits, A. M. Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium. Front Cardiovasc Med. 8, 750243 (2021).
- Sanchez-Fernandez, C., et al. Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration. J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376 (2023).
- Quijada, P., et al. Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium. Nat Commun. 12 (1), 4155 (2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nat Commun. 12 (1), 1771 (2021).
- Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration. Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).
- Stankunas, K., et al. Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease. Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).
- Liu, Y., et al. Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice. J Adv Res. 39, 275-289 (2022).
- Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2014).
- Wong, M. D., et al. 4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging. Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).
- Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
- Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet. Muscle. 5 (1), 22 (2015).
- Eissa, N., et al. Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis. PLOS One. 11 (5), e0156289 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA. Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).
- Carmona, R., Barrena, S., López Gambero, A. J., Rojas, A., Muñoz-Chápuli, R. Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium. FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).
- Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. Peer J. 9, e11165 (2021).
- Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications. JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart. J Vis Exp. 75, e50359 (2013).
