نهج فعال للجينات المعدلة لتوصيل الجينات في القلب الجنيني للفأر
Summary
يقدم هذا البروتوكول إطارا منهجيا مفصلا للجينات المحورة القائمة على التثقيب الكهربائي لخلايا القلب في قلوب الفئران النامية. ستسهل أصول الفيديو المتوفرة هنا تعلم هذه التقنية متعددة الاستخدامات.
Abstract
قلب الثدييات هو عضو معقد يتكون أثناء التطور عبر مجموعات متنوعة للغاية من الخلايا السلفية. إن أصل هؤلاء الأسلاف وتوقيتهم ومصيرهم أمر حيوي للتطور السليم لهذا العضو. الآليات الجزيئية التي تحكم تشكل القلب ضرورية لفهم التسبب في أمراض القلب الخلقية وتجديد القلب الجنيني. استخدمت الأساليب الكلاسيكية للتحقيق في هذه الآليات توليد الفئران المعدلة وراثيا لتقييم وظيفة جينات معينة أثناء نمو القلب. ومع ذلك ، فإن الجينات المحورة للفأر هي عملية معقدة تستغرق وقتا طويلا ولا يمكن إجراؤها في كثير من الأحيان لتقييم دور جينات معينة أثناء نمو القلب. ولمعالجة هذا الأمر، قمنا بتطوير بروتوكول للتثقيب الكهربائي الفعال وزراعة القلوب الجنينية للفئران، مما يمكن الجينات المحورة العابرة من التقييم السريع لتأثير اكتساب أو فقدان وظيفة الجينات المشاركة في نمو القلب. باستخدام هذه المنهجية ، نجحنا في التعبير عن Meis1 في القلب الجنيني ، مع تفضيل نقل الخلايا النخابية ، مما يدل على قدرات التقنية.
Introduction
القلب هو أول عضو يتشكل أثناء التطور الجنيني. تتضمن هذه العملية التنسيق الزماني المكاني لمجموعات مختلفة من الخلايا السلفية من مناطق متميزة من الجنين. كل هذا يحدث بينما يستمر القلب النامي في النبض والعمل ، مع التركيز على التنسيق الرائع المطلوب لتكوينه1،2،3. نظرا للدور الحاسم للقلب ، فإن التنظيم الصارم على المستويين الخلوي والجزيئي ضروري لتكوينه بشكل صحيح 4,5. كان تحديد الآليات التي تتحكم في نمو القلب ذا أهمية كبيرة ، لأنها ضرورية لكشف اضطرابات القلب الخلقية ، والتي تؤثر على عدد كبير من المرضى في جميع أنحاء العالم6. علاوة على ذلك ، يعد فهم نمو القلب أمرا محوريا في فك رموز تجديد القلب ، حيث تحتفظ قلوب الثدييات بعد الولادة بقدرة متجددة تضيع أو تعوق في مرحلة البلوغ 7,8. وبالتالي ، فإن تشريح المنظمين الجزيئيين لنمو القلب أمر حتمي لتعزيز الجهود البحثية حول أمراض القلب الخلقية وتجديد القلب.
سعيا لتحقيق هذا الهدف ، كان هناك تركيز متزايد على التحقيق في دور النخاب في نمو القلب وتجديده9. النخاب هو طبقة رقيقة من النسيج الظهاري المتوسط الذي يتكون من الطبقة الخارجية لقلب الثدييات (الشكل 1). أظهرت الدراسات الحديثة أهمية النخاب أثناء إصابة القلب ، وكشفت أن هذا النسيج قادر على إرسال إشارات الانتشار إلى خلايا عضلة القلب في المنطقة المصابة للتخفيف من الضرر10,11. على الرغم من أهمية النخاب ، فقد واجه إجراء المزيد من التحقيقات الجزيئية تحديا بسبب عدم تجانسه الهائل. كشفت تجارب RNAseq أحادية الخلية عن عدم تجانس النخاب ، حيث تضم مجموعات فرعية متعددة من الخلايا مع توقيعات نسخية مميزة12،13،14،15،16. وبالتالي ، فإن استراتيجية فحص المنظمين المحتملين لتطور القلب يجب أن تستوعب تنوع الخلايا السلفية النخابية.
وبهذا المعنى ، سهلت قابلية نموذج الفأر للتعديل الجيني تحديد العديد من الجينات الحاسمة لنمو القلب ، مما سمح بتوليد خطوط متحولة مع اكتساب الوظيفة (GOF) أو فقدان الوظيفة (LOF) لجينات معينة. ومع ذلك ، فإن هذه النهج تنطوي على استثمار كبير للوقت والموارد التجريبية. لذلك ، فهي غير عملية عند تقييم أدوار عدد كبير من الجينات المرشحة. إلى جانب ذلك ، غالبا ما تمارس الجينات التنموية وظائف متعددة الاتجاهات في أنسجة مختلفة أو تكون مطلوبة للتطور الجنيني المبكر ، مما يعيق تفسير مساهمتها في التطور في عملية محددة. في حين أنه من الممكن استهداف وظيفة الجينات في هياكل محددة أو نقاط زمنية تنموية ، فإن هذا يتطلب عادة استخدام تركيبات جينية أكثر تعقيدا ، والتي قد يكون من الصعب توليدها أو غير متوفرة بشكل عام.
للتغلب على هذه القيود ، نقدم منهجية لإلكتروبور القلوب الجنينية للفأر من أجل الجينات المحورة العابرة (الشكل 2). بالاقتران مع الثقافة خارج الجسم الحي وفرز الخلايا المنشط بالتألق (FACS) ، توضح هذه الاستراتيجية قدراتها من خلال GOF العابر ل Meis1 ، وهو جين مميز جيدا متورط في نمو القلب وتجديده17،18،19. في هذه المقالة ، يتم أيضا استكشاف التطبيقات المحتملة الأخرى لهذه المنهجية ، وتناقش مزاياها وقيودها ، وكذلك مقارنتها بالبروتوكولات الحالية لتعديل التعبير الجيني بشكل عابر. نعتقد أن الإطار والأمثلة المرئية المقدمة ستعزز فهم بيولوجيا النخاب أثناء التطور والمرض.
الشكل 1: طبقات القلب الجنينية للفأر. رسم تخطيطي لمنظر إكليلي لقلب جنيني للفأر E13-14. يتم تمثيل الطبقات الخلوية الرئيسية الثلاث للقلب باللون الأصفر (الشغاف) والأحمر (عضلة القلب) والأزرق (النخاب). يتم تمثيل التامور بخط بني. يتم اختصار غرف القلب الأربع باسم LV ، البطين الأيسر. RV ، البطين الأيمن. لوس أنجلوس ، الأذين الأيسر ؛ RA ، الأذين الأيمن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظرة عامة تخطيطية على بروتوكول التثقيب الكهربائي للقلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Protocol
Representative Results
Discussion
بشكل عام ، تقدم المنهجية الموصوفة هنا إطارا قويا للتعبير عن التركيبات المعدلة وراثيا في النخاب النامي (الشكل 4 ب) ، كما يتضح من التعبير المفرط ل Meis1 (الشكل 4C). مع التركيبات المناسبة ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم تأثير إما كسب الوظيفة (GOF) أو فقدان الوظيف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة RTI2018-097617-J-I00 من وزارة العلوم والابتكار الإسبانية و Acción 9 من جامعة جيان إلى O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 من وزارة العلوم والابتكار الإسبانية ومنحة H2020-MSCA-ITN-2016-722427 من برنامج EU Horizon 2020 إلى MT. تم دعم JMG بزمالة دكتوراه من وزارة العلوم الإسبانية ومؤسسة Severo Ochoa (PRE2022-101884). يتم دعم كل من CNIC و CBMSO من قبل وزارة العلوم الإسبانية ، ويتم دعم CNIC من قبل مؤسسة ProCNIC.
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate | BD Falcon | 353043 | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 40 µm Cell Strainer | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | CLS431751 | |
| Anti-GFP Policlonal Antibody | Invitrogen | A10262 | 1:1000 dilution used |
| Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody | Invitrogen | 14-6503-82 | 1:500 dilution used |
| CD1 Wild Type mice | Provided by Animalary Unit (CNIC) | ||
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signalling Technologies | 9661 | 1:400 dilution used |
| DAPI | Cell Signalling Technologies | 4083 | 1:1000 dilution used |
| Dispase/collagenase | Roche | 10269638001 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51032720 | |
| Leica Stereoscopic Microscope S8AP0 | Leica | 11524102 | |
| Liberase | Roche | 5401119001 | |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
| pCAG expression plasmid | Addgene | #89689 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dishes 35 × 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Petri dishes 60 × 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
| Phenol Red | Merck | P3532 | |
| Pipette tips | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody | Abcam | ab89901 | 1:300 dilution used |
| Square Wave Electroporator CUY21SC | Nepa Gene | CUY664-10X15 | |
| Sterile PBS | Provided and autoclaved by technical unit | ||
| Sucrose | Millipore | 84100 | |
| Tweezer electrodes with variable gap | Nepa Gene | CUY650P5 |
References
- Tyser, R. C., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, e17113 (2016).
- Tyser, R. C. V., et al. Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium. Science. 371 (6533), eabb2986 (2021).
- Sendra, M., Domínguez, J., Torres, M., Ocaña, O. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5 (2021).
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, e30668 (2017).
- Ai, D., et al. Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth. PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).
- Zimmerman, M. S., et al. Global, regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Cao, J., Poss, K. D. The epicardium as a hub for heart regeneration. Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PLOS One. 7 (9), e44692 (2012).
- Hesse, J., et al. Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart. eLife. 10, e65921 (2021).
- Streef, T. J., Smits, A. M. Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium. Front Cardiovasc Med. 8, 750243 (2021).
- Sanchez-Fernandez, C., et al. Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration. J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376 (2023).
- Quijada, P., et al. Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium. Nat Commun. 12 (1), 4155 (2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nat Commun. 12 (1), 1771 (2021).
- Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration. Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).
- Stankunas, K., et al. Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease. Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).
- Liu, Y., et al. Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice. J Adv Res. 39, 275-289 (2022).
- Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2014).
- Wong, M. D., et al. 4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging. Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).
- Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
- Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet. Muscle. 5 (1), 22 (2015).
- Eissa, N., et al. Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis. PLOS One. 11 (5), e0156289 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA. Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).
- Carmona, R., Barrena, S., López Gambero, A. J., Rojas, A., Muñoz-Chápuli, R. Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium. FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).
- Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. Peer J. 9, e11165 (2021).
- Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications. JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart. J Vis Exp. 75, e50359 (2013).
