JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

הסרת המסתורין ב-Vivo Bioluminescence Imaging של מודל עכבר למחלת Chagas למחקרי יעילות תרופות

Published: May 31, 2024
doi:
10.3791/66740
, , , ,
1Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas (ICB),Universidade de São Paulo, 2Drugs for Neglected Diseases initiative (DNDi) Latin America, 3Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia,Universidade Federal de São Paulo, 4Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas,Universidade de São Paulo

Summary

הפרוטוקול המסופק כאן מתאר את השלבים המפורטים לביצוע מחקרי יעילות תרופות במודל ביולומינסנטי של זיהום טריפנוזומה קרוזי , תוך התמקדות ברכישת נתונים, ניתוח ופענוח. נהלי פתרון בעיות ובקרת איכות כדי למזער בעיות טכניות מסופקים גם כן.

Abstract

כדי לשלוט ולהקטין את ההשפעה על בריאות הציבור של מחלות פרוטוזואן אנושיות כגון מחלת צ’אגאס, לישמניאזיס וטריפנוסומיאזיס אפריקאי אנושי, יש צורך בזירוז הפיתוח של תרופות וחיסונים חדשים. עם זאת, תהליך זה מלא בקשיים כגון ביולוגיה מורכבת מאוד של טפילים ופתוגנזה של מחלות, וכאופייני למחלות טרופיות מוזנחות, מימון מוגבל יחסית למחקר ופיתוח. לפיכך, מודלים של מחקר in vitro ו – in vivo שיכולים לשחזר במידה מספקת תכונות מפתח של זיהום ומחלות תוך מתן שימוש רציונלי במשאבים חיוניים לקידום המחקר עבור מצבים אלה. דוגמה אחת היא מודל העכבר in vivo bioluminescence imaging (BLI) עבור מחלת Chagas, אשר מספק זיהוי רגיש מאוד של אור באורך גל ארוך שנוצר על ידי טפילי Trypanosoma cruzi המבטאים לוציפראז. למרות שטכניקה זו הפכה לגישה הסטנדרטית ליעילות תרופות במחקרי vivo , קבוצות מחקר עדיין עשויות להתקשות ליישם אותה בשל היעדר הכשרה מעשית מתאימה לטיפול בציוד ויישום נהלי בקרת איכות, גם כאשר ציוד BLI מתאים זמין. בהתחשב בתרחיש זה, פרוטוקול זה נועד להנחות מתכנון ניסויים לרכישת נתונים וניתוחם, עם פרטים המאפשרים יישום פרוטוקולים בקבוצות מחקר עם ניסיון מועט או ללא ניסיון עם BLI, בין אם עבור מחלת Chagas או עבור מודלים אחרים של עכברים למחלות זיהומיות.

Introduction

מחלת צ’אגאס אנדמית באמריקה הלטינית ומשפיעה על כשבעה מיליון אנשים ברחבי העולם1. מדי שנה, יותר מ -50,000 מקרי מוות והפסדים כלכליים של כ -7 מיליארד דולר נובעים מהאופי המשבית של מחלה זו2. מחלת Chagas נגרמת על ידי פרוטוזואן Trypanosoma cruzi, טפיל hemoflagellate הטרוקסני מסוגל להדביק יונקים (בר ומקומי) וקטורים triatomine (Hemiptera, Reduviidae)3 באמריקה, שם ההעברה הווקטוריאלית מבוססת. נתיבי זיהום חשובים אחרים כוללים עירוי דם, השתלת איברים, דרך הפה (על ידי בליעת מזון מזוהם בטריאטומין נגוע)4, והעברה מולדת. נתיבי שידור לא וקטוריים תרמו להתפשטות מחלת צ’אגאס לאזורים לא אנדמיים 3,5.

מחלת צ’אגאס מתבטאת בשני שלבים קליניים. השלב החריף הוא, ברוב המקרים, אסימפטומטי. זיהומים סימפטומטיים קשורים בדרך כלל עם סימנים לא ספציפיים כגון חום, עייפות, מיאלגיה, לימפדנופתיה, splenomegaly, ו hepatomegaly. השלב החריף קשור לעתים קרובות גם עם טפילות פטנט ומחזור מערכתי של טפילים. מוות עלול להתרחש בעד 10% מהמקרים המאובחנים, במיוחד באלה של זיהום אוראלי6. השלב הכרוני מאופיין לעתים קרובות בתקופה ארוכה של היעדר סימפטומים כלשהם. עם הזמן, כשליש מהחולים שנדבקו עשרות שנים קודם לכן מציגים תופעות לב, בדרך כלל מלוות בפיברוזיס ודלקת שריר הלב, ו/או הפרעות במערכת העיכול הקשורות בעיקר להתפתחות תסמונות מגה-ושט ו/או מגה-קולון 3,5,6.

הטיפול האטיולוגי במחלת צ’אגאס מורכב משתי תרופות בלבד: בנזנידזול וניפורטימוקס. חומרים אנטי-טפיליים אלה זמינים כבר למעלה מ-50 שנה ויש להם רעילות ניכרת ויעילות מוגבלת 5,7,8. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף לפתח טיפולים חדשים, בטוחים ויעילים יותר לחולי מחלת צ’אגאס.

טכניקות מתוחכמות ומדויקות יותר מאפשרות כיום לקבל תשובות לשאלות ישנות המאפשרות התקדמות בחיפוש אחר טיפולים חדשים למחלת צ’אגאס. במובן זה, הקהילה המדעית נהנית מאוד מטפילים מהונדסים גנטית למחקרי in vivo על מהלך הזיהום והערכת יעילות התרופה 9,10,11,12. בדיקת אורך המבוססת על מערכת הדמיה ביולומינסנציה (BLI) מאפשרת הערכת יעילות במהלך ולאחר משטר הטיפול, מה שמוביל לזיהוי תרכובות עם פעילות טריפנוצידית10,13. שיטת BLI מספקת מדידה ישירה של עומס הטפילים, הן במחזור הדם והן ברקמות ואיברים, באמצעות כימות האור המיוצר על ידי T. cruzi CL Brener Luc::Neon lineage11 המהונדס גנטית, המבטא באופן מכונן את הגחלילית לוציפראז12 בעלת ההסטה לאדום.

עם זאת, כמעט 10 שנים לאחר ביסוס מודל BLI של מחלת צ’אגאס ומחקרי יעילות תרופות, רק קבוצות מחקר מעטות שולטות בטכניקה זו. עובדה זו נובעת לא רק מהגישה המצומצמת לציוד הדמיה מתאים, אלא גם מהיעדר הכשרה וזמינות של פרוטוקולים מובנים ומפורטים. שיטה זו מציגה מספר יתרונות על פני גישות אחרות, המסתמכות על הערכת פרזיטמיה במיקרוסקופיה, סרולוגיה או הערכת זיהום איברים/רקמות על ידי qPCR לזיהוי DNA טפילי, שכן היא מאפשרת שיפור רווחת העכברים והפחתת השימוש בבעלי חיים על ידי האפשרות ליצור נתונים חזקים ומשולבים יותר in vivo. יתר על כן, שיטה זו היא, ניתן לטעון, רגישה יותר, שכן היא מאפשרת גילוי מוכן של מוקדי טפילים באיברים הקרביים לאחר טיפול תרופתי10,12. לכן, פרוטוקול זה נועד להנחות קבוצות מחקר על פרזיטולוגיה ומחלות זיהומיות אחרות לבסס מתודולוגיה זו במעבדותיהם על ידי פירוט ההליכים הטכניים. כאן, אנו חולקים את הניסיון שהושג באמצעות יישום מודל BLI של מחלת צ’אגאס בברזיל, הראשון מסוגו באמריקה הלטינית, כחלק ממאמצי גילוי התרופות המתואמים על ידי יוזמת התרופות למחלות מוזנחות (DNDi).

Protocol

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה הוגשו, אושרו ונערכו בהתאם להנחיות14 שנקבעו מראש על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של המכון למדעי החיים באוניברסיטת סאו פאולו: פרוטוקול CEUA ICB/USP no 5787250522. 1. פתרונות הערה: שקול את הנפח המנוהל מראש של 10 מ”ל/ק”ג (200 μL עבור עכבר 20 גרם משקל)15,16. לדוגמה, הכינו תמיסת עבודה של 15 מ”ג/מ”ל כדי להגיע למינון של 150 מ”ג/ק”ג מן החי. רכב מתלה הידרוקסיפרופיל מתילצלולוז (HPMC-SV)הערה: הריאגנטים הנדרשים הם 0.5% (w/v) הידרוקסיפרופיל מתילצלולוז (HPMC), 0.4% (v/v) טווין 80 ו-0.5% (v/v) בנזיל אלכוהול.עבור 200 מ”ל של פתרון הרכב, לשקול 1 גרם של HPMC ולהמיס 64 מ”ל של מים חמים ultrapure . מערבבים במשך 2 דקות. מוסיפים 120 מ”ל מים אולטרה-טהורים קרים כקרח ומערבבים במשך שעה. מוסיפים 1 מ”ל של בנזיל אלכוהול. לאחר מכן מוסיפים 0.8 מ”ל של Tween 80 בטכניקת הפיפטינג ההפוך וממשיכים לערבב עד שהתמיסה הופכת לשקופה. התאם את הפתרון לנפח הסופי של 200 מ”ל. אחסן את HPMC-SV בקירור (4°C) למשך 3 חודשים לכל היותר. Benznidazoleחישוב הסכום הדרוש של פתרון מורכב, כדלקמן:נפח תמיסה מורכבת = (מספר מנות בכל יום x מספר ימים x מספר עכברים שיש לטפל בהם x נפח מנוהל בכל עכבר) + 30% תוספת. לשקול את הסכום הדרוש של benznidazole (BZ), בהתחשב במינון הרצוי. לטיפול מרפא, מינון פומי של 100 מ”ג / ק”ג פעם ביום במשך 10 ימים משיג ריפוי של 100% במודל CD כרוני17. בהתחשב בנפח הסופי הרצוי, חשב את הכמות המתאימה כדי להגיע לריכוז של 5% (v/v) DMSO ולהמיס לחלוטין BZ ב- DMSO מסודר. הוסף את הנפח המתאים של הרכב לצינור זכוכית כדי להגיע לריכוז של 95% (v/v) HPMC-SV. העבר את ה- BZ המומס ב- DMSO לצינור הזכוכית המכיל HPMC-SV. הומוגני נמרצות את המתלה ולאחסן אותו ב 4 °C (75 °F).לדוגמה: נפח סופי של נוסחת BZ = 10 מ”ל (שלב 1.2.1)כמות BZ = 100 מ”ג (שלב 1.2.2)5% DMSO = 0.5 מ”ל (שלב 1.2.3) ו- 95% HPMC-SV = 9.5 מ”ל (שלב 1.2.4) לפני כל מתן תרופות, ניסוחים ממוקמים באמבט מים קולי במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס הומוגני במרץ לפני מינון בעלי חיים. ציקלופוספמידלהמיס את הכמות הדרושה של cyclophosphamide במים טהורים במיוחד כדי להשיג פתרון 12.5 מ”ג / מ”ל. יש לעקר את התמיסה על ידי סינון ולאחסן בטמפרטורה של 4°C. כתם Giemsaלהמיס 0.6 מ”ג של מגיב אבקת Giemsa ב 50 מ”ל של מתנול. מוסיפים 25 מ”ל גליצרול ומערבבים. הסר משקעים באמצעות נייר סינון ומשפך. אחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורת החדר (RT), מוגנת מפני אור. הכן פתרון עבודה על ידי דילול 10 מ”ל של תמיסת Giemsa ב- 90 מ”ל של חיץ מיקס-פוספט (20.5 M Na2HPO4, 65.4 M KH2PO4 ב- pH 7.2). 2. תרבות טריפנוזומה קרוזי עבודה בארון בטיחות ביולוגי (BSC), לטפח 4 x 106 epimastigotes/mL של T. cruzi CL ברנר לוק::ניאון11 במדיה LIT (68.44 mM NaCl, 5.36 mM KCl, 112.7 mM Na2HPO4, 5 גרם / ליטר טריפטון, 5 גרם / ליטר מרק עירוי כבד, 0.03 M hemin, 4.16 mM גלוקוז), בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS), 100 מיקרוגרם/מ”ל פניצילין, 100 U/mL סטרפטומיצין ו-150 מיקרוגרם/מ”ל היגרומיצין כתרופה סלקטיבית ב-28°C. הטפילים בדרך כלל משיגים שלב נייח תוך 3-4 ימים. לגרום metacyclogenesis כדי לקבל טפילים זיהומיות על ידי דגירה 3 x 108 epimastigotes ב 10 מ”ל של מדיום חרקים של גרייס עם 10% (v/v) FBS ב 15 מ”ל צינורות חרוטי ב 28 ° C במשך 7-10 ימים. הערך את שיעור הבידול על ידי מריחות מכתימות Giemsa. בשביל זה, להפיץ 20 μL של טפילים מובחנים במגלשת זכוכית ולתת להתייבש במשך 10 דקות. במכסה אדים, המשיכו עם קיבוע הדגימה על ידי כיסוי מגלשת הזכוכית במתנול מסודר ותנו להתייבש לחלוטין (1-2 דקות). כסו את מגלשת הזכוכית בפתרון העבודה של Giemsa למשך 20 דקות. שטפו בעדינות את מגלשת הזכוכית במים מזוקקים. במיקרוסקופ, לספור את אחוז trypomastigotes metacyclic. אם הושג שיעור בידול של לפחות 10 אחוזים, המשך לשלב הבא. צנטריפוגה את הטפילים (120 x גרם במשך 10 דקות) ולהשעות את הגלולה עם 10 מ”ל של DPBS. צנטריפוגה פעם נוספת ולהשעות מחדש את הטפילים ב 5 מ”ל של DMEM בתוספת 10% (v/v) של FBS, 100 מיקרוגרם / מ”ל פניצילין, ו 100 U / mL סטרפטומיצין. ב 25ס” מ 2 צלוחיות תרבית, לבצע את הזיהום של 1.66 x 105 LLC-MK2 תאים (תאי אפיתל כליות מ Macaca mulatta) ב 37 ° C ב 5% CO2, באינקובטור לח18. טריפומסטיגוטים של תרבית רקמות (TCTs) משוחררים בתווך לאחר 8-9 ימים. להדביק תאים טריים LLC-MK2 monolayers עם TCTs בריבוי של זיהום (MOI) של 1:40. 3. ניתוח הומוגניות אוכלוסיית טריפנוזומה קרוזי לפי ציטומטר זרימה אספו TCTs של הזנים CL Brener Luc::Neon ו-CL Brener wild, צנטריפוגות ב-120 x גרם למשך 10 דקות, והשעו מחדש את ה-TCTs ב-DPBS. התאם את צפיפות הטפיל כדי להשיג 1 x 106/mL. המשך בניתוח אוכלוסייה לפי ציטומטר זרימה בהתבסס על פלואורסצנטיות mNeonGreen (לדוגמה 506/em. 517 ננומטר)19, וקבל לפחות 20,000 אירועים עבור כל דגימה.הערה: אחוז האוכלוסייה הפלואורסצנטית מתקבל על ידי השוואת סוג הבר מול הטפיל הנגוע. כדי להמשיך עם זיהום העכברים, יש להשיג לפחות 95% מאוכלוסיית הטפילים הפלואורסצנטיים של שושלת CL Brener Luc::Neon (איור משלים 1). 4. זיהום ניסיוני בעכברים הערה: כדי להגדיל את כמות הטפילים, טריפומסטיגוטים בזרם הדם (BT) מתקבלים לעתים קרובות מעכברים מדוכאי חיסון10,13. כאן, דיכוי חיסוני כימי של עכברי BALB/C משמש להשגת BT. לשם כך, דיכוי חיסוני קל מושג עם ארבע זריקות intraperitoneal של cyclophosphamide (CTX) ב 62.5 מ”ג / ק”ג עם מרווחים של 96 שעות, אשר מבוצע במקביל זיהום T. cruzi. יש לתת 62.5 מ”ג/ק”ג של ציקלופוספמיד סטרילי על ידי הזרקה תוך צפקית (i.p.) יום אחד לפני זיהום T. cruzi . להדביק כל עכבר עם 1 x 104 TCTs ב 0.2 מ”ל של DPBS דרך המסלול intraperitoneal. תשומת לב לסיכון הגבוה לאירועים בעת טיפול בפתוגנים ומחטים. בצע את הזיהום ב- BSC, לובש כפפות ומגן פנים במהלך כל ההליך. עקוב אחר הטפילים מדי יום על ידי תצפית ישירה על BT בדם (שיטת פיצי-ברנר)20. בשיא הטפילים, בסביבות 13-17 ימים לאחר ההדבקה (dpi), לנהל את איסוף הדם. לשם כך, מרדימים עכברים עם 100 מ”ג / ק”ג קטמין ו 10 מ”ג / ק”ג xylazine. כאשר עכברים מורדמים לחלוטין21, המשך עם ניקוב הלב באמצעות מזרק 1 מ”ל המחובר למחט 24 G X3/4 המכילה 50 μL של 3.8% (w/v) נתרן ציטראט. נתק את המחט והכנס בעדינות את הדם לצינור צנטריפוגה. ב BSC, לבצע דילול של aliquot של דם ב אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) ליזה חיץ ולספור את הטפילים בחדר נויבאואר. חזור על הליך זה לפחות פעמיים, מכיוון שקרישי דם קטנים משפיעים על ספירת הטפילים.הערה: כדי למנוע שגיאות ספירה, התאם את גורם הדילול כדי למנוע ספירות נמוכות מ-30 וגבוהות מ-300 טריפומסטיגוטות בתא נויבאואר. התאם את צפיפות הטפיל ל 5 x 103 BT / mL על ידי ערבוב הכמות הדרושה של דם טהור ב- DPBS. להדביק עכברי BALB/c שאינם מדוכאי חיסון עם 1 x 103 BT ב 0.2 מ”ל של DPBS לכל עכבר (5 x 103 BT / mL) על ידי מסלול intraperitoneal באמצעות מחט 26 G (מחטים צרות יותר להוביל טפיל ליזה)22. לאחר הזרקת עוצמת הקול intraperitoneally, להחזיק את המחט בתוך העכבר במשך 5 שניות כדי למנוע זרימה חוזרת. הניחו את העכברים הנגועים באופן זמני בקופסה עם מגבת נייר כדי לזהות דליפה או דימום פוטנציאליים ולאחר מכן החזירו עכברים לכלובים שלהם. 5. הדמיה in vivo הערה: מילון המונחים המשמשים כאן הוא כדלקמן: מפגש הדמיה: רכישת ביולומינסנציה המבוצעת בכל הקבוצות של ניסוי מסוים ביום נתון. איור 1A מציג סקירה כללית של ההליך. סבב הדמיה: הליך המבוצע בתת-קבוצות של שלושה עכברים, מהזרקת D-לוציפרין ועד התאוששות מהרדמה. מומלץ שכל קבוצת ניסוי תכיל 6 עכברים, בשל השונות הפנימית של עומס הטפילים בעכברים וגורמים אחרים המשפיעים על כימות BLI המתואר להלן. רכישת הדמיה: צילום המבוצע על ידי ציוד ההדמיה כדי לכמת ביולומינסנציה, מה שמביא לשכבת על של תמונה של תצלום והביולומינסנציה המכומתת מוצגת כסולם פסאודו-צבע. הליך הדמיה: כל השלבים הנדונים במפגש זה של הפרוטוקול. איור 1: השגת נתוני BLI. (A) דיאגרמה של זרימת עבודה של רכישה המיושמת במחקרים על מחלות זיהומיות, תוך שימוש במודל העכבר הביו-לומינסנטי של מחלת Chagas כדוגמה. עכברים הנגועים ב- T. cruzi מהונדס גנטית מנותחים על ידי הדמיה in vivo בנקודות הזמן שנקבעו. בכל סבב הדמיה מוזרקים לקבוצות של עד שלושה עכברים 150 מ”ג/ק”ג של אנזים-סובסטרט (D-luciferin). לאחר 5 דקות, ההרדמה ניתנת ב 2.5% (v/v) isoflurane בחמצן. כאשר הם חסרי תנועה לחלוטין, עכברים ממוקמים במערכת הדמיה, והרכישה מתחילה בעקבות ההגדרות שהוגדרו. לאחר ההדמיה, העכברים מתאוששים מההרדמה ומוחזרים לכלובים. שאלות וסוגיות תכופות שהחוקרים עשויים להיתקל בהן במהלך הרכישה מודגשות באדום. תוכנית זו שונתה מ Lewis et al. (2014)12 (נוצר עם BioRender.com: UD26KWEVS2). (B) קינטי In vivo של D-luciferin/גחלילית מוסטת לאדום (PpyRE9h). עכברים בשיא T . cruzi parasitemia (n = 3) הורדמו והוזרקו להם 150 מ”ג/ק”ג D-luciferin. התמונות נרכשו במשך שעה (זמן חשיפה: 2 דקות; binning: 4). למעלה: כימות שטף גחוני כולל (p/s) (ציר Y שמאלי, באדום) וכאחוז המדידה הממוצעת הגבוהה ביותר (ציר Y ימני, בכחול). הנתונים מוצגים כממוצע (עקומות) וסטיית תקן (אזור מוצלל). למטה: תמונות שנרכשו של אות ה- BLI הראשון (4 דקות), אות ה- BLI הגבוה ביותר (30 דקות) והאחרון (62 דקות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. בדוק את הסרגל הירוק בחלון רכישה כדי לוודא אם מצלמת ההתקן המצמיד לטעינה (CCD) קרה ( -90 ° C). לחץ על הסרגל (ירוק או אדום) כדי לדמיין את הטמפרטורה.הערה: בהתאם למדריך ציוד ההדמיה, ציוד ההדמיה והתוכנה צריכים להיות מופעלים כל הזמן כדי לשמור על CCD קר. ודא אם בוצעה התאמת הרקע האוטומטית. לשם כך, לחץ על Acquisition > Background > View available Dark Charge. תופיע רשימה עם מספר שילובי הגדרות.הערה: הליך זה מפחית רעשי הארה. אם התצורה שנבחרה גורמת לערך גבוה מ- 1000, בהתבסס על הנוסחה “זמן חשיפה x (binning²)”, אין להתעלם ממטען כהה. בהתאם לתצורות התוכנה, ניתן להציג בינינג כמספר (גורם בינינג) או בטווח שבין ‘קטן’ ל’גדול’. את ההתאמה בין הטווח לגורם המחייב ניתן למצוא במדריך המכשיר. אם חלון הפעילות (האזור הלבן בתחתית התוכנה) אינו מוצג, הפעל אותו בתצוגת תפריט > בחלון פעילות. הגדר את אזור ההדמיה על ידי לחיצה על חלון רכישה > שדה הראייה. אופציה ג’ (13.2 ס”מ) רוכשת 3 עכברים, ואופציה ד ‘ (22 ס”מ) רוכשת 5 עכברים. בחר באפשרות השמירה האוטומטית על ידי לחיצה על רכישה > שמירה אוטומטית ובחר או צור תיקיה חדשה עבור כל נקודת זמן. הניחו נייר שחור מט על אזור ההדמיה ומקמו את שקופיות המחיצה בניצב בין המפרצונים. אם היצרן לא סיפק את השקפים, השתמש בחתיכות (3 ס”מ x 15 ס”מ) של נייר שחור מט. כוונן את האזור הפנימי של תא ההדמיה כך שיתאים את חרוטי האף מזכוכית לפתחי ההרדמה. השתמש בחתיכות קטנות של סרט חשמלי שחור כדי לחבר את מערכת ההרדמה לפלטפורמה (מחוץ לאזור התמונה).הערה: בגרסאות מסוימות של התקני הדמיה, לייזר מגדיר את אזור ההדמיה. אם כלי זה אינו זמין, רכוש תמונות דרך התוכנה כדי לבדוק את שקופיות המחיצות באזור ההדמיה. הגדר את מאדה isoflurane על 2.5% (v/v) בחמצן עבור תאי הדימות והאינדוקציה. בדוק לפי מד הלחץ אם הגז זורם דרך המערכת21.הערה: אם במכשיר ההדמיה לא מחוברת מערכת הרדמה באינהלציה, אפשרויות הרדמה אחרות אפשריות, כגון קסילזין בהזרקה וקטמין23. במקרה זה, התאוששות העכברים איטית, והסיכון למוות גבוה24. מלא מזרקים (31 גרם מחטים) עם D-luciferin (פרוטוקול מקיף להכנת D-luciferin מסופק על ידי ספקים שונים)25,26, להגן עליהם מפני אור ישיר, ולהכין כמה מיכלי פלסטיק או כלובים נוספים על ידי כיסוי הפנים עם מגבת נייר. שמור שעון / שעון בקרבת מקום כדי לעקוב בקלות אחר הזמן ומחברת מעבדה כדי לרשום קבוצות עכברים, זמן הזרקת לוציפרין, וכל מידע אחר במהלך ההליך. שקלו את כל העכברים ורשמו את משקלם. סמן כל עכבר בטוש עט או קעקוע על הזנב. שמור על זיהוי עכברים מוצג היטב במהלך הניסוי כולו. שלב זה יכול להתבצע גם יום לפני הרכישה.הערה: הסימן לא אמור לתפוס שטח גוף גדול מכיוון שהדיו עלול להפריע לאות הביולומינסנטי. סמנים קבועים של צבעים שונים יכולים גם לעזור להבדיל בין הקבוצות. כדי להתחיל את הפעלת ההדמיה, רשום תמונת רקע זוהרת (הגדרות: זמן חשיפה: 5 דקות; בינינג: ‘גדול’ או ’16’, f/stop: 1) של תא הדמיה ללא עכברים. הליך זה מסייע לזהות מקורות אור זוהרים אוטומטיים או בעיות לא רצויות בציוד.הערה: מכיוון ש-BLI מבוסס על תגובה אנזימטית, הזמן הוא מאפיין חיוני של הניסוי. בדוק את כל הפריטים המפורטים לעיל ואת הגדרות הציוד לפני תחילת הטיפול בבעלי חיים. הזריקו 150 מ”ג/ק”ג (כלומר) של D-לוציפרין ב-3 העכברים הראשונים מבלי להגיע לאיברים פנימיים. הניחו את העכברים בקופסת המיכל כדי להעריך אם D-luciferin דולף (תמיסה צהובה בהירה). רשום הערות אם זה קורה ורשום את קבוצת העכברים ואת זמן הזרקת D-luciferin. המתינו 5 דקות ואז העבירו את העכברים לתא השראת ההרדמה. הפעל את המערכת. לוקח לעכברים בערך 3 דקות להיות בהרדמה מלאה (היעדר תגובות כמו רגליים רועדות, זנב וכו ‘) 21. פתח את דלת מכשיר ההדמיה, הפעל את זרם ההרדמה לתא ההדמיה, ובמקביל כבה את תא ההשראה. הניחו כל עכבר במצב חרוטי האף: מעכבר 1-3, משמאל לצד ימין. התאימו בעדינות את העכברים עם צד הגחון כלפי מעלה בתוך אזור ההדמיה המוצג על ידי הלייזר. במהלך האירוח, ודאו את תעודת הזהות והמיקום של העכברים. אין לכפות כניסה של עכברים מורדמים חלקית בקונוסים באף. הניחו את מגלשות ההפרדה בין עכברים וסגרו את דלת ציוד ההדמיה. התאם את הגדרות הרכישה בחלון רכישת תוכנה, באופן הבא:עבור עכברים שאינם נגועים, זמן חשיפה = 5 דקות / בינינג = ‘גדול’ או ’16′(קבוצת תצורות רגישה ביותר מבחינה מתמטית להגדרת ערכי הסף). עבור עכברים נגועים במודל האקוטי: זמן חשיפה = 2 דקות/ בינינג = ‘בינוני’ או ‘4’. עבור עכברים נגועים במודל הכרוני: זמן חשיפה = 5 דקות/ בינינג = ‘גדול’ או ’16’. ודא אם זמן הזרקת D-luciferin בוצע לפחות 10 דקות לפני תחילת הרכישה. אם לא, המתינו את פרק הזמן הדרוש כדי לקבל את התמונות במהלך שיא אות הלוציפראז (איור 1B); אחרת, לחץ על רכוש כדי להתחיל ברכישת ההדמיה. החלון תוויות תמונה יופיע לאחר תחילת ההדמיה. מלא את התיבות במידע המתאים על כל קבוצה, כולל זמן הזרקת לוציפרין, ניסוי, זיהוי עכברים, נקודת זמן וכל מידע רצוי אחר שיכול לסייע בשמירת רשומה. מידע זה ייכלל בקובץ טבלת המדידות. בדוק אם סימן האזהרה תמונה רוויה מוצג בסוף רכישת ההדמיה. תמונות רוויות אינן מקובלות. במקרה כזה, הקטן את האיגוד וקבל תמונה חדשה. רשום הערות שיש לקחת בחשבון בניתוח. לאחר רכישת התמונה, פתח את דלת מכונת ההדמיה וסובב את העכברים לתצוגה הגבית (הצד האחורי למעלה). בצע את הרכישה שוב ותייג אותה בהתאם. בסוף רכישת ההדמיה, כבה את זרימת ההרדמה. הוציאו בעדינות את העכברים מתא ההדמיה והניחו אותם במיכל. רשום את משקל הגוף של העכברים תוך התבוננות בהתאוששות מההרדמה. רשום כל התנהגות חריגה או חריגות גוף שנמצאו במהלך ההליך. ברגע שהעכברים חוזרים לנוע, הכניסו אותם לכלובים שלהם.הערה: בדוק את עוצמת BLI עבור כל תמונה שנרכשה. לאחר סיום הרכישה, התמונה הביולומינסנטית המוקלטת והתצלום יוצגו בתוכנה בקנה מידה אוטומטי שאין לקחת בחשבון. הגדר את קנה המידה המוגדר בניתוח נתונים (מתואר להלן) בחלון לוח כלים . 6. ניתוח נתונים הערה: הפרוטוקול לעיל מבוסס על תוכנת הדמיה מסחרית in vivo . עם זאת, גרסה ללא רישיון תוכנה יכולה לבצע את הניתוח הבסיסי ביותר. ניתן למצוא את פרטי התוכנה בטבלת החומרים. פתח קבצים.פתח את התיקיה המכילה את הנתונים שנרכשו מנקודת זמן הדמיה מסוימת על-ידי בחירה באפשרות Menu File > Browser > בחר את התיקיה (איור 2A – שלב 1).הערה: חלון חדש ייפתח בפורמט טבלה עם כל הנתונים שנרכשו שנשמרו בקובץ שנבחר. הוא יציג את סימן מספר הלחיצה , שהוא מזהה התמונה שניתן באופן אוטומטי על ידי התוכנה (נתונים ומספרי שעות), את המידע שסופק על ידי החוקר בחלון תוויות תמונה במהלך הרכישה, והגדרות רכישה. כל הנתונים הללו עוזרים למיין את התמונות שניתן להשתמש בהן בניתוח, בהתחשב בכך שאין להשתמש בתמונות רוויות. בחר שורות מרובות הקשורות לתמונות שנבחרו, כולל הפקדים שאינם נגועים. רשמו את מזהה התמונה במחברת המעבדה יחד עם המידע שנרשם במהלך ההדמיה. הרכיבו את התמונות שנבחרו על ידי לחיצה על טען כקבוצה. הליך זה יוצר תמונת רצף חדשה. לכן, ניתן להתאים תכונות עבור כל התמונות בו זמנית. שמור את תמונת הרצף החדשה בתיקייה חדשה שונה מזו ששימשה בשלב 6.1 כדי להקל על ניתוח מחדש של נתונים גולמיים במידת הצורך. בתמונת הרצף, זהו את האיגוד המשמש לכל תמונה על-ידי לחיצה על אפשרויות > תצוגה > בחירת גורם איגוד (איור 2A – שלב 2). גורם הקישור הנרכש יוצג בחלק העליון של כל תמונה ברצף. תקן את כל גורמי האיגוד לאותו מספר. לשם כך, לחץ פעמיים על התמונה שברצונך להתאים. בחלון לוח הכלים > המקטע התאמת תמונה , בחר את גורם הקישור המתאים (איור 2A – שלב 3) – ראה שלב 5.18 לבחירת גורם binning. בצע הליך זה בכל התמונות המסתעפות.הערה: הליך זה משפיע ישירות על כימות BLI (טבלה 1) והוא מטופל בהמשך בסעיף הדיון. הגדר קנה מידה.הבחין בין אות ביולומינסנט חוקי (מעל 600 ספירות בהתאם למדריך המכשיר) בהתבסס על הבקרה שאינה נגועה. לשם כך, לחץ פעמיים על התמונה של העכברים שאינם נגועים. לאחר מכן, בפינה השמאלית העליונה של החלון החדש, בחר באפשרות ספירות בשדה יחידות . לאחר מכן, התאם את סרגל הצבעים לערך המינימלי של 600. התמונה המתקבלת תהיה קו הבסיס להגדרת קנה המידה המינימלי בזוהר. כשחלון הרצף פעיל, בחר באפשרות Radiance בשדה Units . התאימו את סרגל הצבעים ואת טבלת הצבעים בלוח הכלים. לשם כך, השבת את התיבה Individual באזור Color Scale Limits . סמן את התיבות בקנה מידה לוגריתמי וידני (איור 2A – שלב 4). קבעו את מספרי קנה המידה המינימליים בהתאם לבקרות הלא נגועות (כפי שנצפה בשלב 6.8) והאזור עם האות הגבוה ביותר כמקסימום (כפי שמוצג באיור 2A על-ידי החיצים).הערה: In vivo 2D light mesurament הוא כימות יחסי. ניתן למצוא ערכי קנה מידה שונים עקב הבדלים בגרסה ובכיול של כל מכשיר. לכן, הערכים שהודגמו בתוצאות המייצגות לא יכלו להתאים לניסויים אחרים שבוצעו במכשירים אחרים ובכל זאת להיות תקפים באותה מידה על פי הבקרות הפנימיות (לא נגוע ולא נגוע לא מטופל). לאחר קביעת קנה מידה זהה לכל התמונות, לחץ פעמיים על כל תמונה, הגדל את החלון וייצא את תצוגת התמונה בפורמט תמונה (.jpg, .tiff וכו ‘) באמצעות הלחצן ייצוא גרפיקה , מתן שמות לקבצים לפי נקודה treatment_miceID_time. (איור 2A – שלב 5). בצע הליך זה עבור כל התמונות. בצע מדידות.בחר תמונה כלשהי מהרצף ולחץ עליה פעמיים. בחלון לוח הכלים > מקטע כלי החזר השקעה , לחץ על כפתור הריבוע (איור 2B- שלב 1) וצייר מלבן המכסה את העכבר כולו. לחץ על הגבול של החזר ההשקעה שנוצר והעתק והדבק את אותו החזר השקעה עבור כל עכבר (וכתוצאה מכך שלושה ROI בתמונה). שמור את החזר ההשקעה על ידי לחיצה על שמור במקטע כלי החזר השקעה. החל את החזר ההשקעה השמור על כל התמונות על ידי בחירת התיבה החל על רצף ולאחר מכן לחץ על טען. ההחזר על ההשקעה שנשמר ישמש עבור כל העכברים בניסוי כולו. התאם את מיקום החזר ההשקעה בכל עכבר כך שיתאים טוב יותר לבעל החיים באזור המדידה. כאשר כל העכברים מסומנים, לחצו על הלחצן ‘מדידת החזר השקעה’ (איור 2B- שלב 2). טבלת מדידות החזר ההשקעה תופיע. בחר סוגי מדידה: זוהר; תכונות תמונה: כל הערכים האפשריים; החזר השקעה מידות: ס”מ. לאחר מכן, לחץ על בחר הכל כפתור, ואחריו העתק לחצן. הדבק את הנתונים ישירות בתוכנת ניתוח טבלאות (גיליון אלקטרוני). לחלופין, ייצא קובץ בתבנית .csv או .txt. עבוד על הנתונים.בתוכנת ניתוח טבלאות, ארגן את הנתונים לפי קבוצות (טיפול, שליטה לא נגוע, לא מטופל וכו ‘). עומס הטפילים מוצג כביולומינסנציה של כל הגוף. לכן, סדרו את הנתונים כך שיתאימו לערכי השטף הכולל הגחוני והגבי של אותם עכברים וסכמו אותם. חישוב הממוצע וסטיית התקן של הערכים המסוכמים בהתחשב בכל קבוצה (לדוגמה: טבלה משלימה 1). התווה את הנתונים לתוכנת גרפים וסטטיסטיקה. הכן חלונית עם תמונות ביו-לומינסנטיות בתוכנת תמונה או מצגות שקופיות. מקם כל עכבר בעמודה ובכל נקודת זמן בשורה כדי לבנות מטריצת יעילות תרופתי כדי להקל על תצוגה חזותית ופרשנות של הנתונים.הערה: קיימת אפשרות לבנות את התמונות ישירות לתוך תוכנת הדמיה מבלי לבצע את שלב 6.2.4 (הצג > חלון פריסת תמונה). עם זאת, ממשק התוכנה והכלים מגבילים את ארגון הנתונים. איור 2: שלבי ניתוח הנתונים מהגדרת קנה מידה של תמונה לכימות עוצמת האור. (A) תצוגת תוכנת תמונה חיה לעיבוד נתוני תמונה. שלב 1: העלה את הנתונים שנרכשו כרצף באמצעות דפדפן כלי. שלב 2: זהה את האיגוד המשמש לכל רכישה (יופיע מעל התמונות הבודדות). שלב 3: הגדר את כל התמונות של עכברים נגועים לאותו גורם קשירה והחל גורם קישור 16 עבור העכברים שאינם נגועים. שלב 4: הגדר את סקאלת הצבעים באופן ידני בהתבסס על עכברים לא נגועים (חץ סגול), שיש לראות על המסך כלא ביולומינסנטיים, ועכברים נגועים ולא מטופלים במוקדים הביולומינסנטיים הגבוהים ביותר (חץ אדום), שיש לראותם כאדומים. שלב 5: כדי לקבל תמונה ללא כל מידע כתוב, לחץ פעמיים על כל תמונה וייצא את התמונה באמצעות יצוא גרפיקה לחצן. (ב) תצוגה של כלי אזורי עניין (ROI). שלב 1: ציירו החזר השקעה המכסה כולו עכבר והעתיקו והדביקו את אותו החזר השקעה עבור כל חיה. שמור את החזר ההשקעה המותאם והחל אותם על כל התמונות בניסוי. שלב 2: לחץ על מודד ROI כפתור ליצירת הטבלה לייצוא .csv או .txt. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 7. הליך Ex vivo יש להזריק 150 מ”ג/ק”ג D-luciferin i.p. לעכבר (אחד לכל סיבוב ex vivo ) ולהמתין 3 דקות. מרדימים את העכברים באמצעות 100 מ”ג/ק”ג קטמין ו-10 מ”ג/ק”ג קסילזין i.p. בארון בטיחות ביולוגי, כאשר העכבר אינו מגיב כלל לצביטה של הכפות, חתכו את עור העכבר כדי לחשוף את הצפק (מבלי לפתוח את חלל הצפק) ואת רקמת בית השחי השמאלי. המשך עם exsanguination על ידי חיתוך עורק השחי וכלי שיט. לאסוף את הדם באמצעות פיפטה פסטר חד פעמי. לאחר מכן יש לנקב 10 מ”ל של 0.3 מ”ג/מ”ל של D-luciferin בתמיסת DPBS דרך החדר השמאלי של הלב. הניחו את האיברים שנבחרו על כתמים שנקבעו מראש על צלחת פטרי והשרו אותם בתמיסת d-luciferin של 0.3 מ”ג / מ”ל. הליך זה חייב להתבצע תוך 30 דקות לכל היותר. רכוש את התמונה הזוהרת של האיברים שנכרתו (לב, ריאות, בלוטת התימוס, כבד, שריר הארבע ראשי, מזנטריה, טחול, כליות, בלוטת יותרת הכליה, שומן ויסצרלי, ושט, קיבה, מעי דק, צקום, מעי גס, מוח, שומן תת עורי, רחם, שומן גונדל, שלפוחית השתן וקרום הצפק) באמצעות 5 דקות של זמן חשיפה וקשירת 16, בהתאם לעוצמת האות (תמונות רוויות אינן מקובלות)22.הערה: יש לבצע את אותו הליך בעכבר שאינו נגוע לפני העכבר הנגוע כדי לקבוע את הסף.

Representative Results

באמצעות מודל עכבר מתאים המבוסס על טפילים טרנסגניים המבטאים באופן מכונן לוציפראז, ניתן לשחזר תכונות מפתח של זיהום T. cruzi אנושי הגורם נזק מינימלי לפונדקאי, המאפשר מעקב בזמן אמת אחר הטפילים על ידי BLI של כל הגוף של הפונדקאי באופן אורכי (לכל החיים), עד מספר חודשים12. איור 3 מראה ניסוי פיילוט שמדגים את מסלול הזמן של זיהום CL Brener Luc::Neon infection מהיום הראשון שלאחר ההדבקה ועד 150 dpi בעכברי BALB/c. ב-20 dpi הראשונים, עומס הטפילים המוסק על ידי ביולומינסנציה עולה, אופייני לשיא הטפילים, ואחריו ירידה חדה בעומס הטפילים, עקב שליטה חיסונית של עכברים. לפיכך, השלב החריף של הזיהום נחשב הראשון 50 dpi. השלב הכרוני מוגדר כאשר הזיהום מגיע לקצב ביולומינסנט קבוע, בין 100-150 dpi. איור 3: הבנת המודל. קינטיקה של Trypanosoma cruzi CL Brener Luc::זיהום ניאון בעכברי BALB/c (n = 11). פאנל עליון: תמונות ביולומינסנטיות גחוני וגבי מנקודות זמן שונות במשך 150 יום לאחר ההדבקה (dpi) עם טריפומסטיגוטים של זרם הדם 1 x 10³ על ידי הזרקה תוך צפקית. סולם מפת חום (ביומן10) של אות ביולומינסנטי בקרינה (p/s/cm2/sr). קוד צבע: סגול = 5 x 103; אדום = 1 x 107. לוח תחתון: כימות אות ביולומינסנטי בשטף כולל (p/s) של עכברי גוף שלם. הנתונים מבוטאים כאמצעים (קווים) וסטיות תקן (אזורים מוצללים). תקופות המוגדרות לשלבים חריפים וכרוניים של זיהום במודל עכבר זה מודגשות בכתום. ערכי ממוצע Luminescence של עכברים לא נגועים (n = 3) מוצגים כסף (קו אפור בהיר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. ניתן גם לחזות את התוצאות הטיפוליות מכיוון שהשלבים העיקריים של הזיהום משוכפלים היטב במודל עכבר. לפיכך, BLI מיושם כעת במדע תרגומי באמצעות מחקרי הוכחת היתכנות התומכים בקבלת החלטות לגבי פוטנציאל יעילות מורכב והתקדמות בצנרת הפיתוח10,27. במודל העכבר החריף, הטיפול האוראלי צריך להתחיל כאשר הזיהום מגיע לשיא הטפילים (סביב 14-21 dpi), המאופיין במספר גבוה של טריפומסטיגוטים בזרם הדם (כ 1 x 105 trypomastigotes / מ”ל – נתונים לא מוצגים) וזיהום מערכתי. בשלב הכרוני, הטיפול בעכברים מתחיל ב 100 dpi, כאשר עומס הטפיל הוא הרבה יותר נמוך, עם טפיל יציב subpatent. כדי להדגים את היישום של הפרוטוקול המתואר לעיל בהערכה של חומרים אנטי-טפיליים, השווינו את יעילות הטיפול של benznidazole (BZ), התרופה הסטנדרטית המשמשת לטיפול במחלת Chagas, ו- posaconazole (Posa), מעכב סטרול 14α-demethylase (CYP51) שנכשל בניסויים קליניים למחלת Chagas, ושהוכח גם כלא יעיל כסוכן אנטי-טפילי נגד T. cruzi in vitro ו- in vivoכולל במודל BLI המתואר בפרוטוקול זה 13,18,28,29,30., עבור מודל העכבר החריף, קבוצות של 6 עכברים בכל קבוצה טופלו דרך הפה על ידי gavage31 במשך 20 יום עם Posa ב 20 מ”ג / ק”ג או BZ ב 100 מ”ג / ק”ג, פעם ביום. עכברים טופלו גם עם BZ במשך 5 ימים במינון של 100 מ”ג/ק”ג פעם ביום כדי להעריך את ההשפעה של טיפולים קצרים. לאחר סילוק התרכובות (10 ימים לאחר סיום הטיפול), העכברים עם BLI שלילי עברו דיכוי חיסוני, מצב שמעודד הישנות של זיהום כאשר לא מושגת תרופה פרזיטולוגית (איור 4A). הטיפול בפוזה הביא להפחתה של 99.49% ± 0.27% (ממוצע ± סטיית תקן) בנטל הטפיל המוסק על ידי ביולומינסנציה בסוף הטיפול ונשאר ברמות דומות של עכברים לא נגועים במהלך תקופת חיסול תרכובת התרופה (למעט עכבר #3, עם אות חולף ב 40 dpi, ועכבר #2, שהדגים נקודת BLI חלשה ב 44 dpi). בהשוואה לקבוצה שלא טופלה, טיפול BZ במשך 20 יום הפחית 100% ± 0.01% את נטל הטפיל המוסק ביולומינסנציה בסוף הטיפול. לעומת זאת, הטיפול הקצר ב-BZ במשך 5 ימים הוביל לירידה של 99.98% ±-0.03% ב-19 dpi (בדומה לרמת הסף). אולם במקרה זה, הפחתת ה-BLI הייתה חולפת, וברכישות הבאות כל העכברים הציגו הפעלה מחדש של זיהום (איור 4B). איור 4: תכנון ניסוי הוכחת היתכנות ותוצאות שהתקבלו באמצעות הדמיית ביולומינסנציה במודל אקוטי של מחלת צ’אגאס. (A) תרשים סכמטי של תהליך ציר הזמן במודל עכבר מחלת צ’אגאס חריפה למחקרים פרה-קליניים להערכת יעילות מורכבת. נקודות שחורות: נקודות זמן של הדמיה. בקבוק תרופות ובר כתום: תחילת הטיפול וסופו, בהתאמה. סמל מזרק: זריקות cyclophosphamide. DPI: יום לאחר ההדבקה. קוד צבע: אפור = זיהום לא מטופל; כתום = תקופת הטיפול; כחול = שלב חיסול מורכב; צהוב = תקופת דיכוי חיסוני. (B) זמן-מהלך הטיפול ב-Trypanosoma cruzi. פאנל שמאלי: תמונות ביולומינסנציה גחונית של עכברי BALB/c (i) שלא טופלו או טופלו במשך 20 יום עם (ii) posaconazole (Posa) ב-20 מ”ג/ק”ג, (iii) benznidazole (BZ) ב-100 מ”ג/ק”ג שטופלו במשך 20 יום ו-(iv) BZ ב-100 מ”ג/ק”ג שטופלו במשך 5 ימים עם (n = 6/קבוצה). כל הטיפולים ניתנו דרך הפה על ידי gavage (10 מ”ל / ק”ג) פעם ביום. מפת חום בקנה מידה10 מציינת את עוצמת האות הביו-לומינסנטי מרמה נמוכה (כחול) לגבוהה (אדום). גרף ימני: כימות כל הגוף של נתוני הדמיה ביולומינסנציאלית. הנתונים מבוטאים כאמצעים (קווים) וסטיות תקן (אזורים מוצללים). מפתח: בקבוק תרופות: תחילת הטיפול (14 dpi); סרגל כתום: סוף הטיפול (18 dpi/33 dpi); מזרק סמל cyclophosphamide זריקות (מיום 44-53); נקודה כתומה: עכבר מנותח על ידי הליך ex vivo ; § הנתונים אינם נכללים עקב דליפת D-luciferin בשתן. (C) הליך Ex vivo לזיהוי מוקדי T. cruzi באיברים וברקמות. מפתח חלוקת הצלחת מוצג בתחתית האיור (נוצר באמצעות BioRender.com: ZY26LG8AOF). אותו סולם זוהר כפי שמוצג בלוח vivo . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. במודל זה, טיפול אנטי-טפילי עשוי להפחית את עומס הטפילים מתחת למגבלת גילוי BLI של 1000 טפילים. לפיכך, עכברים מופיעים כשלילי BLI10. כדי להבטיח כי תרופה פרזיטולוגית הושגה, יש צורך לקדם דיכוי חיסוני של עכברים באמצעות טיפול cyclophosphamide29,32. עכברים שעדיין יש להם עומס טפיל בלתי ניתן לגילוי לאחר טיפול תרופתי יהפכו לחיוביים ל- BLI לאחר דיכוי חיסוני. השפעה זו מוצגת בהרחבה רבה יותר על ידי טיפול פוסה במודל החריף, המקדם הישנות טפילים. בניסוי הזה, הליך ex vivo בוצע על עכברים עם האות הביולומינסנטי הנמוך ביותר כדי להעריך טרופיזם של רקמת הטפיל (איור 4C). עכברים שאינם מטופלים מראים אותות ביולומינסנטיים חזקים, במיוחד במערכת העיכול (TGI) וברקמות הקשורות כגון שומן ויסצרלי ומזנטריה. בנוסף, העור היה אתר הקשור להתמדה של טפיל. עכברים שטופלו בפוזה הציגו כתמים ביולומינסנטיים בעוצמה נמוכה יותר שהיו מוגבלים יותר למעי הגס, למזנטריה ולשומן הקרביים. מצד שני, בעכברים שטופלו במשטר טיפול מרפא, כמו BZ 100 מ”ג / ק”ג במשך 20 יום, לא מזוהה אות bioluminescent אפילו תחת דיכוי חיסוני. לכן, בהתחשב בכך שלאחר קידום תנאים לאות ביולומינסנטי העולה מעל רמת הסף של 1000 טפילים10, והגברת הרגישות על ידי חשיפת האיברים הקרביים, נחשב כי BZ 100 מ”ג / ק”ג במשך 20 יום מספק ריפוי סטרילי. הערכת הריפוי הסטרילי אומתה בעבר בטכניקות שונות 10,13,17,33,34. תכנון מחקר דומה יושם על המודל הכרוני (איור 5A), שבו עכברים (n = 6 / קבוצה) החלו להיות מטופלים ביום ה -100 לאחר ההדבקה. בשלב זה, Posa 20 מ”ג / ק”ג, BZ ב 100 מ”ג / ק”ג, או 10 מ”ג / ק”ג פעם ביום ניתנו דרך הפה במשך 20 ימים. לאחר תקופת חיסול התרופה, העכברים שליליים ל- BLI היו מדוכאי חיסון. בנוסף, כדי להעריך ריפוי סטרילי, עכברים שהיו עדיין שליליים ל- BLI בסוף שלב הדיכוי החיסוני היו נתונים לניתוח ex vivo . בזיהום כרוני, הטיפול בפוזה במינון של 20 מ”ג/ק”ג הוביל לירידה של 95.03% ±-6.18% בנטל הטפיל המוסק על ידי ביולומינסנציה בסוף הטיפול ונשאר ברמות דומות של עכברים לא נגועים במהלך תקופת חיסול התרופה. לאחר הדיכוי החיסוני, רוב העכברים הראו רמה משתנה של אות BLI והתפלגותו (איור 5B). הליך Ex vivo גילה שלעכבר אחד שקיבל BLI שלילי מכל הגוף שטופל ב-Posa היה כתם ביולומינסנטי במעי הגס שניתן היה לזהות באמצעות בדיקת ex vivo (איור 5C). איור 5: תכנון ניסוי הערכת תרופות ותוצאות שהושגו במודל הכרוני של זיהום טריפנוזומה קרוזי באמצעות דימות ביולומינסנצי. (A) תרשים סכמטי של תכנון ניסוי של מודל עכבר מחלת צ’אגאס כרונית. נקודות שחורות: נקודות זמן של הדמיה. בקבוק תרופות ובר כתום: תחילת הטיפול וסופו, בהתאמה. סמל מזרק: זריקות cyclophosphamide. Dpi: יום לאחר ההדבקה. קוד צבע: אפור = זיהום לא מטופל; כתום = תקופת הטיפול; כחול = שלב חיסול מורכב; צהוב = דיכוי חיסוני; לילך = הישנות. (B) הערכה אורכית של יעילות הטיפול במודל הכרוני של מחלת צ’אגאס. פאנל שמאלי: BLI גחוני של עכברי BALB/c (i) שלא טופלו או טופלו במשך 20 יום עם (ii) posaconazole (Posa) במינון 20 מ”ג/ק”ג; (iii) benznidazole (BZ) ב-100 מ”ג/ק”ג, ו-(iv) BZ ב-10 מ”ג/ק”ג (n = 6/קבוצה). כל הטיפולים ניתנו דרך הפה על ידי gavage פעם ביום. גרף ימני: סכום נתוני השטף הכולל הגחוני והגבי. מפתח: בקבוק תרופות: תחילת הטיפול (102 dpi); בר כתום: סוף הטיפול (121 dpi); פס צהוב וסמל מזרק: זריקות ציקלופוספמיד (מהיום 131-142). נקודה כתומה: עכבר מנותח על ידי הליך ex vivo . ! עכבר מת במהלך ההרדמה. העכבר מציג הפרעות בבטן. סולם מפת חום (Log10) מציין את עוצמת הביולומינסנציה ביחידת הקרינה מרמה נמוכה (3 × 10,5 ככחול) לגבוהה (1 × 10,7 כאדום). (C) ניתוח Ex vivo של T. cruzi tropism ברקמה. זיהוי ביולומינסנציה של איברים שנכרתו מעכברים מדוכאי חיסון in vivo שליליים ל-BLI לאחר טיפול ב-Posa ו-BZ ב-100 מ”ג/ק”ג או עכברים עם האות הנמוך ביותר בקבוצות שלא טופלו ו-BZ בקבוצות של 10 מ”ג/ק”ג. מפתח חלוקת הלוחות מוצג בתחתית האיור (נוצר באמצעות BioRender.com: ZY26LG8AOF). סולם הזוהר שווה ללוח in vivo . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. הטיפול ב-BZ במינון של 100 מ”ג/ק”ג הפחית את הביולומינסנציה לרמות סף (93.87% ±-2.14%) ברזולוציה של 122 dpi והלאה עד סוף הניסוי. בהתחשב בניתוח ex vivo , BZ השיג שיעור ריפוי של 100% (6/6 עכברים), מכיוון שאף עכבר לא הציג חזרה של אות ביולומינסנטי גם כאשר נבדקו איברים מדוכאי חיסון ופנימיים. זה אומר חוסר הישנות. עם זאת, משטר הטיפול ב- BZ עם ריכוז נמוך יותר הביא לירידה קלה של ביולומינסנציה (85.95% ± 18.43%) אך ללא תרופה, מכיוון שעכברים המשיכו להראות מוקדי אות ביולומינסנטיים הניתנים לזיהוי בכל נקודות הזמן שלאחר מכן. לפיכך, מודל זה מאפשר הבחנה כמותית בין טיפולים לא יעילים (פוסקונזול וטיפול תת-אופטימלי בבנזנידזול) לבין טיפולים יעילים (מינון ומשך טיפול אופטימליים בבנזנידזול). איור משלים 1: ניתוח טרום הדבקה של ביטוי אוכלוסיית T. cruzi של לוציפראז על ידי מדידת הגן המדווח mNeonGreen fluorescence. ציטומטריית זרימה של חלבון פלואורסצנטי mNeonGreen מבוטא באופן קונסטיטוטיבי על ידי CL Brener Luc::Neon parasite. היסטוגרמה מנורמלת של מספר הטפיל (ציר Y) על ידי עוצמת פלואורסצנטיות mNeonGreen (ציר X). מקרא פנימי מדגים את הזן והצורה המנותחים, חציון הפלואורסצנטיות ואחוז האוכלוסייה הפלואורסצנטית. קווי השער מוגדרים על ידי זן CL Brener wild type (WT) כבקרה שאינה פלואורסצנטית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. טבלה משלימה 1: דוגמה לטבלת ניתוח במדידת BLI. נתונים גולמיים שהתקבלו מכימות הדמיית ביולומינסנציה של היום ה-19 לאחר ההדבקה במודל החריף ששימש בתוצאות המייצגות המוצגות באיור 4B. תיאור קבוצות: שליטה כעכברים שאינם נגועים (n = 3/group); רכב כעכברים נגועים שאינם מטופלים; posaconazole (Posa) ב 20 מ”ג / ק”ג במשך 20 ימים; benznidazole (BZ) ב 100 מ”ג / ק”ג במשך 20 ימים; BZ ב 100 מ”ג / ק”ג מטופל במשך 5 ימים (n = 6 / קבוצה). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

דימות ביולומינסנציה היא שיטה פורצת דרך המאפשרת זיהוי גן דיווח באמצעות ספקטרום נראה ואינפרא אדום של קרינה אלקטרומגנטית. לכן, אין צורך בסמנים מסומנים ברדיו כדי לעקוב אחר הדגימה שלך35. BLI מתאים לדגמי מכרסמים ומינים קטנים אחרים. זה מאוד שימושי עבור מחקרים פרה-קליניים כי זה בטוח יותר ומאפשר כמה סיבובי תמונה, גרימת אי נוחות מינימלית לבעלי חיים. חוץ מזה, הדמיה in vivo הוא גמיש מאוד בשל האפשרות של שילוב bioluminescence, פלואורסצנציה, וטכניקות אחרות כגון טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים36.

הדמיה אופטית נשלטת על ידי תכונות פיזיקליות אופטיות, כמו בליעה ופיזור. כל הרקמות בולעות ומפזרות אור באורכי גל מובחנים באופן שונה37. שלב קריטי אחד הוא בחירת גן כתב מבלי לקחת בחשבון את אורך הגל הנפלט של האור המופק על ידי התגובה הכימית. בעוד שרמת ביטוי גנים של כתב עשויה להיות גבוהה במבחנה בבדיקות ביולומינסנטיות, ייתכן שלא יושגו אותן רמות ביטוי כאשר מתקדמים להגדרת in vivo. בפרוטוקול זה, השתמשנו בגרסה ממוטבת קודון Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H)38 המוסטת לאדום עבור טריפנוסומאטידים9, אשר פולטת אור ב-617 ננומטר, אחד המתאימים ביותר למחקרי in vivo 39. אורכי גל שאורכם עולה על 600 ננומטר נספגים פחות ומפוזרים על ידי כרומופורים אנדוגניים בגוף, במיוחד המוגלובין ומלנין. לכן, נורות אדומות יכולות להיות מועברות דרך כמה סנטימטרים של רקמות, מה שמאפשר לפוטונים להגיע למצלמת CCD אפילו מתוך רקמות הקרביים39,40.

אחד התחומים המדאיגים במסגרות הדמיה הוא היעדר הבנה מקיפה של תפקודן והשפעותיהן. Binning, טכניקת עיבוד מקדים, משלבת את המידע הנרכש על ידי גלאים רציפים לפיקסל גדול יותר. תהליך זה משפר את יחס האות לרעש, מפחית רעשי רקע ומשפר את הרגישות. עם זאת, הוא מקטין את דיוק הרזולוציה המרחבית, והתוצאה היא תמונה מפוקסלת41,42. פשרה זו היא שיקול חשוב באסטרטגיית ההדמיה שלך.

בהתבסס על פרופיל מוצר היעד ופרופיל מועמד היעד למחלת צ’אגאס34, מחקר הוכחת ההיתכנות מתמקד ברגישות לזיהוי T. cruzi ולעזור לקבוע אם תרופה חדשה מועמדת יכולה להשיג תרופה סטרילית (המיוצגת על ידי חוסר הישנות לאחר מספר סבבי דיכוי חיסוני). לכן, אנו מבצעים את ה- BLI באמצעות גורם האיגוד הגבוה ביותר מבלי להרוות את התמונה. כאשר התמונה רוויה במיוחד, רכישה חדשה מתבצעת באמצעות גורם בינינג נמוך יותר. במהלך הניתוח, תיקון מתמטי מוחל על התמונות שדרשו binning שונה. בדרך זו, הנתונים הסופיים צריכים להיות מוצגים באמצעות אותו binning. טבלה 1 מדגימה את הערכים השונים שהתקבלו כאשר גורמי איגוד ייחודיים הוחלו באותה תמונה ובהחזר השקעה.

טבלה 1: השפעת הגדרות binning על כימות BLI. כימות של שלושה ROI על התמונה של מודל אקוטי (d13) ומודל כרוני (d118), מנותחים בגורמי binning שונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

בשל התרחיש הנוכחי של מחלת Chagas במרפאה, מאמצי גילוי תרופות שואפים לחסל לחלוטין טפילים (ריפוי פרזיטולוגי)27,34. לכן, הפרוטוקול הפרה-קליני in vivo כולל גישות המתגברות על מגבלות הרגישות הטכנית של BLI. אחת הגישות היא טיפול בעכברים עם ציקלופוספמיד כדי להפחית את התגובה החיסונית השולטת בעומס הטפיל. אסטרטגיה נוספת היא צמצום עומק הרקמה והסרת שכבות של שרירים, עור ופרווה שחוסמות את נתיב האור אל המצלמה. באמצעות הליך ex vivo ניתן לזהות כתמים ביולומינסנטיים קטנים, החושפים מוקדי טפיל מתחת לסף in vivo BLI, כפי שמוצג באיור 5C בתוצאות ex vivo של עכבר שטופל על-ידי Posa.

תכנון ניסוי פיילוט להערכת המודל עצמו ודינמיקת הזיהום הוא חיוני לביסוס ניסוי מדויק להערכת יעילות תרופות אנטי-טפיליות. לפיכך, החוקר יוכל להגדיר מראש את הגדרות ה- BLI המתאימות ואת מהלך זמן ההדבקה. בניסוי גישוש, כלי אחד שיכול להיות מועיל להגדרת הגדרות הרכישה הוא ‘חשיפה אוטומטית’. בעזרת כלי זה, החוקר קובע את העדיפות של שלוש הגדרות (זמן חשיפה, Binning ו – F/Stop) כדי להשיג את התמונה הטובה ביותר האפשרית. בפרט, על החוקר לוודא כי התמונות נרכשות בטווח הדינמי של מצלמת CCD, ללא סופר-רוויה או תת-חשיפה, אשר ניתן לבדוק באמצעות גבולות המינימום והמקסימום של קנה המידה ותכונת החשיפה האוטומטית (תפריט עריכת העדפות > > רכישת כרטיסיות > חשיפה אוטומטית של טאבים). בפרוטוקול זה, מפתח הצמצם של המצלמה הוגדר בערך המרבי (F/Stop: 1), והוגדרו זמני חשיפה שונים וגורמי קשירה שונים עבור מודלים אקוטיים וכרוניים. הגדרות אלה מעניקות יכולת חיזוי זמן לביצוע סבבי תמונה שונים בו-זמנית. בהתחשב בכך ששיטת הכתב מבוססת על תגובה אנזימטית, הן הפיזור הביולוגי של המצע לתוך העכבר והן הקינטיקה של לוציפראז משפיעות על האות הביו-לומינסנטי, ולכן על כימות הזיהום (איור 1B). כתוצאה מכך, רכישת תמונות ברגעים שונים של קינטיקה אנזימטית מציגה שונות נתונים שלא ניתן להסביר או לתקן ומשפיעה על חישוב השטף הכולל (פוטונים/שנייה) או הקרינה (פוטונים/שנייה/ס”מ2/סטרדיאן). חוץ מזה, זיהום T. cruzi מציג מיקום מרחבי דינמי בעכברים (אזורים ורקמות שונים, עומק, עומס טפילים). לפיכך, קביעת ערך של ספירות לרכישה עלולה להחמיץ מקורות אות חלשים יותר (מספר נמוך של טפילים בנקודה מסוימת עמוק יותר ברקמה) אם מקור אות חזק יותר עומד בקריטריוני החשיפה האוטומטית שהוגדרו.

תכונה מסובכת של תוכנת Living Image היא הצגת התמונה שנרכשה בסקאלת צבעים אוטומטית. אין אפשרות להגדיר מראש את קנה המידה כך שיציג באופן אוטומטי תמונה נרכשת חדשה לגמרי בהתאם לערכי קנה המידה שנבחרו (ראה שלב פרוטוקול 6.2). מצב זה מאלץ את החוקר לשנות ידנית את התמונות בזו אחר זו לערכי המקסימום והמינימום שנבחרו. כתוצאה מכך, למשתמשים שאינם מנוסים ולא מאומנים היטב אין את הקריאה המתאימה במהלך הפעלת הרכישה, והם עלולים להטעות את הנתונים או לאבד מידע חשוב באותה נקודת זמן. לשם כך, ניסוי הפיילוט מועיל.

אחת השאלות הנפוצות ביותר לגבי תכנון ניסוי הוכחת היתכנות היא כיצד לבחור את משך הטיפול ואת המינון. עבור ישויות כימיות חדשות, פרמטרים אלה מוגדרים בדרך כלל על ידי עוצמת התרכובת וסלקטיביות במבחנה, בשילוב עם נתונים שנוצרו על ידי מטבוליזם של תרופות ופרמקוקינטיקה (DMPK) ומחקרי סבילות שנערכו לפני בדיקת יעילות in vivo. לסיכום, לאחר זיהוי תרכובות המסוגלות להרוג באופן סלקטיבי את הטפיל בתוך התאים, מבוצעים ניסויי ADME הראשונים (ספיגה, פיזור, חילוף חומרים והפרשה) במבחנה כדי להעריך בין היתר את המסיסות המימית של התרכובות, חדירות התאים והיציבות המטבולית. אם תרכובות מראות איזון טוב של תכונות במבחנה (המוגדרות בדרך כלל בפרופילי מועמדים למטרה), אז מועמדים אלה מתקדמים למחקרי פרמקוקינטיקה in vivo (PK) בעכברים בריאים, המתארים את החשיפה לתרכובת בדם (ואולי גם ברקמות) ומספקים מושג כללי על הסבילות ברמות מינון שונות17, 34,43. באופן אידיאלי, מטרת הערכת PK ברוב המחלות הזיהומיות היא לקבוע את ההיתכנות להגיע לריכוזי פלזמה חופשיים (מתוקנים עבור קשירת חלבון פלזמה) שהם מעל ריכוזי EC50/EC90 44 – הריכוז היעיל שהורג או לפחות מעכב את הצמיחה של 50% או 90% של טפילים, בהתאמה – לתקופה ארוכה מספיק של זמן. אם מספיק חשיפה מושגת ברמת מינון מסוימת, אז משטר זה יכול לשמש במהלך מחקרי היעילות באמצעות מודל Chagas BLI. עבור מחקרי מיקום מחדש של תרופות, נתוני PK in vitro ו– in vivo צריכים להיות זמינים. התחלה טובה לשחזור פרופיל של תרופות היא מאגרי מידע כימיים כגון PubChem45, המספקים נתונים מוכרים שניתן להמיר לעכברים באמצעות קנה מידה אלומטרי46 כדי להעריך משטרי טיפול בטוחים ולא רעילים שיש לבדוק. עם זאת, זה לא תמיד כך. מחקרי PK הם עדיין תחום שמתעלמים ממנו במדע האקדמי, וחברות פארמה מעטות מפרסמות את תוצאות ה-PK שלהן. הקהילה המדעית לגילוי תרופות ממליצה לכלול הערכת PK in vivo יחד עם מבחני יעילות תרופות (פרמקודינמיקה)47. לכן, הדמיה פרה-קלינית תואמת למדידות מורכבות בו זמנית, וגישה נלווית זו משפרת את עמידות הנתונים.

בנוסף, הטיפול בעכברים, משקלם ומצבם הבריאותי מנוטרים לאורך כל הניסוי. סימנים של רעילות ותופעות לוואי כגון כיפוף, רעד, אובדן שיווי משקל, חוסר רצון לזוז, חוסר רצון להאכיל או לשתות, השתטחות או כל חריגה אחרת הקיימת בקבוצה או על ידי תנאי עכבר בודדים יש לרשום ולדווח במחקרים פרה-קליניים. אחת המטרות של הדמיה אופטית היא להבטיח את רווחתם של בעלי החיים. לפיכך, נקודות קצה אנושיות צריכות להיות מיושמות בעכברים עם סימני כאב המתוארים בסולם גרימס48. כמו כן, עכברים נשקלו מדי שבוע במהלך רכישת BLI, ולעתים קרובות יותר, במהלך מינון תרופות וטיפול CTX. בהתאם לתקנות רווחת בעלי חיים, עכברים שמאבדים יותר מ-20% ממשקל גופם חייבים לעבור המתת חסד הומנית מיידית.

המודל הביו-לומינסנטי של T. cruzi הוא כיום המודל הניסיוני החדיש ביותר לגילוי ופיתוח טיפולים חדשים למחלת צ’אגאס. מודל המשכפל תכונות מפתח של זיהום T. cruzi ומחלת Chagas49, המאפשר ניטור בזמן אמת של פרזיטמיה והתמיינות של תרכובות עם פרופילי יעילות מגוונים הקשורים לדרכי פעולה ידועות. BLI היא טכניקה המשפרת את האסרטיביות בזיהוי רקמות נגועות. הוא מאפשר בחירה מדויקת של רקמות נגועות במגוון רחב של גישות, כולל כל השיטות הקלאסיות שכבר יושמו במחקר T. cruzi 50,51. בנוסף, הוא מאפשר לחוקרים לחקור טכנולוגיות חדשניות ולפתח טכנולוגיות חדשות33. בנוסף, BLI מספק שיפור רווחת בעלי חיים ושימוש רציונלי יותר על פי עקרונות 3Rs10,35, בבת אחת.

מספר קבוצות מחקר המתמקדות במחלות טרופיות מוזנחות ממוקמות במדינות שבהן מכשירי הדמיה in vivo אינם זמינים. כדי להתגבר על התרחיש הנוכחי, רשתות בינלאומיות חדשות כמו Global BioImaging והקונסורציומים הקשורים אליהן מקדמות פעולות כדי לספק גישה פתוחה למתקני ליבה של הדמיה ולשפר את הכשרת הצוות ומדעני הדימות52,53. יוזמות אלה, יחד עם פרוטוקולי משתמש ידידותיים כמו זה, יכולים להרשות לעצמם תנאים לדמוקרטיזציה של טכנולוגיות מתקדמות עבור כל החוקרים. יישום שיטה זו בגילוי התרופות הפרה-קליניות הציע קריאת יעילות מוצקה וערך ניבוי של תוצאה קלינית המאפשרת גילוי תרופות למחלת צ’אגאס.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לאמנדה פרנצ’יסקו, ג’ון קלי ופאני אסקודיה על מתן הכשרה ותמיכה ב-BLI בבדיקות יעילות תרופות, לג’ון קלי וסימון קלדרנו על אספקת טפילים, ולגבריאל פאדילה על התמיכה במחקרים בבעלי חיים. A.C.S קיבלה מלגת CAPES PSDE להכשרה בבית הספר להיגיינה ורפואה טרופית בלונדון (בריטניה). המחברים גם רוצים להודות לפלטפורמת Flow Cytometry and Imaging Research (FLUIR) במתקן הליבה למחקר מדעי – אוניברסיטת סאו פאולו (CEFAP-USP) על התמיכה הטכנית בניתוח ציוד IVIS Spectrum, ולמעבדה לגנטיקה ובקרה סניטרית ICB-USP על הבדיקות שלאחר הניסוי לבקרת איכות של עכברים כנטולי פתוגנים ספציפיים. פרויקט זה מומן על ידי DNDi. DNDi אסירת תודה לתורמים שלה, ציבוריים ופרטיים, שסיפקו מימון לכל פעילויות DNDi מאז הקמתה בשנת 2003. רשימה מלאה של תורמי DNDi ניתן למצוא באתר https://dndi.org/about/donors/.

Materials

BD LSRFortessa™ X-20 Cell Analyzer BD Biosciences
Weighing Balance (animal facility) Available from several suppliers
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Revvity (former PerkinElmer)
FlowJ Software v10.7.1 BD Biosciences
Living Image Software for Spectrum v4.7.1 Revvity (former PerkinElmer) License Free Analysis Software called 'Aura Imaging' could be used for the most basic features provided by Spectral Instruments Imaging (Bruker company) (https://spectralinvivo.com/software/)
Microsoft Office software Microsoft
GraphPad Prism v8.4.0 GraphPad Software Inc.
DMEM Low Glucose Vitrocell D0025
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
Foetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000-044
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Trypsin 0.5% EDTA Gibco 25300-062
LIT medium In house
Hygromycin B (50 mg/mL) Gibco 10687010
Grace′s Insect Medium Sigma-Aldrich  G9771
HEPES Sigma-Aldrich  54457
IVISBrite d-luciferin potassium salt Revvity (former PerkinElmer) 122799 Also could be used: VivoGlo Luciferin, in vivo grade (Promega/P1043); D-Luciferin, Monopotassium Salt (Thermo Scientific/88293) or PierceD-Luciferin, Monosodium* Salt (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potassium Salt (GoldBio/LUCK or eLUCK); D-Luciferin, Sodium* Salt (GoldBio/LUCNA or eLUCNA) *Sodium or potassium salt differences relies minimal chances on solubility, however do not affect in vivo performance. 
DPBS Gibco 21600-044
Cyclophosphamide (CTX) Sigma-Aldrich C0768-5g
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D5879
(Hydroxypropyl)methyl cellulose (HPMC) Sigma-Aldrich 09963-25G
Benzyl alcohol Sigma-Aldrich 402834
Tween 80 Sigma-Aldrich  P1754-1L
Benznidazole ELEA
Posaconazole (Noxafil commercial formulation) Schering-Phough
Giemsa Available from several suppliers
gavage needle (stainless-steel straight) – 22GA Aton  CA2003
1 mL Syringe and 31G needle Available from several suppliers
1 mL Syringe and removable 26G needle Available from several suppliers
1 mL Syringe and removable 24G X¾ needle Available from several suppliers
Sterile Syringe Filter 0.2 µm Available from several suppliers
A4 Matte Black paper 120gr or thicker Paper Color/ Canson (Available from several suppliers)
aluminum foil Available from several suppliers
Neubauer chamber Available from several suppliers
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO fact sheet. Chagas disease (also known as American trypanosomiasis). WHO, World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/chagas-disease (2023)
  2. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infect Dis. 13 (4), 342-348 (2013).
  3. Bern, C. Chagas’ disease. N Engl J Med. 373 (5), 456-466 (2015).
  4. Shikanai-Yasuda, M. A., Carvalho, N. B. Oral transmission of Chagas disease. Clin Infect Dis. 54 (6), 845-852 (2012).
  5. Lidani, K. C. F., et al. Chagas disease: From discovery to a worldwide health problem. Front Public Health. 7, 166 (2019).
  6. Perez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  7. Field, M. C., et al. Anti-trypanosomatid drug discovery: An ongoing challenge and a continuing need. Nat Rev Microbiol. 15 (7), 447 (2017).
  8. Kratz, J. M. Drug discovery for chagas disease: A viewpoint. Acta Trop. 198, 105107 (2019).
  9. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing ‘red-shifted’ luciferase. PLoS Negl Trop Dis. 7 (11), e2571 (2013).
  10. Lewis, M. D., Francisco, A. F., Taylor, M. C., Kelly, J. M. A new experimental model for assessing drug efficacy against Trypanosoma cruzi infection based on highly sensitive in vivo imaging. J Biomol Screen. 20 (1), 36-43 (2015).
  11. Costa, F. C., et al. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Negl Trop Dis. 12 (4), e0006388 (2018).
  12. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).
  13. Francisco, A. F., et al. Limited ability of posaconazole to cure both acute and chronic Trypanosoma cruzi infections revealed by highly sensitive in vivo imaging. Antimicrob Agents Chemother. 59 (8), 4653-4661 (2015).
  14. du Sert, N. P., et al. The arrive guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 18 (7), e3000410 (2020).
  15. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  16. Turner, P. V., Pekow, C., Vasbinder, M. A., Brabb, T. Administration of substances to laboratory animals: equipment considerations, vehicle selection, and solute preparation. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 614-627 (2011).
  17. Francisco, A. F., et al. Nitroheterocyclic drugs cure experimental Trypanosoma cruzi infections more effectively in the chronic stage than in the acute stage. Sci Rep. 6, 35351 (2016).
  18. Moraes, C. B., et al. Nitroheterocyclic compounds are more efficacious than CYP51 inhibitors against Trypanosoma cruzi: implications for Chagas disease drug discovery and development. Sci Rep. 4, 4703 (2014).
  19. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  20. de Araújo-Jorge, T. C., de Castro, S. L. . Chagas Disease: Manual for Animal Experimentation. , (2000).
  21. JoVE. JoVE Science Education Database. Anesthesia Induction and Maintenance. JoVE. , (2023).
  22. Taylor, M. C., et al. Exploiting genetically modified dual-reporter strains to monitor experimental Trypanosoma cruzi infections and host-parasite interactions. Methods Mol Biol. 1955, 147-163 (2019).
  23. Keyaerts, M., et al. Inhibition of firefly luciferase by general anesthetics: effect on in vitro and in vivo bioluminescence imaging. PLoS One. 7 (1), e30061 (2012).
  24. Jiron, J. M., et al. Comparison of isoflurane, ketamine-dexmedetomidine, and ketamine-xylazine for general anesthesia during oral Procedures in rice rats (Oryzomys palustris). J Am Assoc Lab Anim Sci. 58 (1), 40-49 (2019).
  25. GoldBio. GoldBio Luciferin In Vivo Handbook – a detailed method for Luciferin preparation and administration for model animals. GoldBio Protocol Available from: https://goldbio.com/documents/1068/Luciferin%20in%20vivo%20handbook.pdf (2013)
  26. Revity. Preparation of IVISbriteTM D-Luciferin for in vitro and in vivo bioluminescent assays. Revvity Standard Operate Procedure (Tech Notes) Available from: https://resources.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/SOP_LuciferinPrep_InVitroInVivo_BLI-Assays.pdf (2023)
  27. Chatelain, E., Scandale, I. Animal models of Chagas disease and their translational value to drug development). Expert Opin Drug Discov. 15 (12), 1381-1402 (2020).
  28. Khare, S., et al. Antitrypanosomal treatment with benznidazole is superior to posaconazole regimens in mouse models of Chagas disease. Antimicrob Agents Chemother. 59 (10), 6385-6394 (2015).
  29. Bustamante, J. M., Craft, J. M., Crowe, B. D., Ketchie, S. A., Tarleton, R. L. New, combined, and reduced dosing treatment protocols cure Trypanosoma cruzi infection in mice. J Infect Dis. 209 (1), 150-162 (2014).
  30. Molina, I., et al. Randomized trial of posaconazole and benznidazole for chronic Chagas’ disease. N Engl J Med. 370 (20), 1899-1908 (2014).
  31. JoVE. Science Education Database. Compound Administration II. JoVE. , (2023).
  32. Pukhalsky, A. L., Toptygina, A. P., Viktorov, V. V. Immunosuppressive action of cyclophosphamide in mice: Contribution of some factors to determination of strain differences. Int J Immunopharmacol. 15 (4), 509-514 (1993).
  33. Francisco, A. F., et al. Comparing in vivo bioluminescence imaging and the Multi-Cruzi immunoassay platform to develop improved Chagas disease diagnostic procedures and biomarkers for monitoring parasitological cure. PLoS Negl Trop Dis. 16 (10), e0010827 (2022).
  34. Kratz, J. M., et al. The translational challenge in Chagas disease drug development. Mem Inst Oswaldo Cruz. 117, e200501 (2022).
  35. Youn, H., Hong, K. -. J. In vivo noninvasive small animal molecular imaging. Osong Public Health Res Perspect. 3 (1), 48-59 (2012).
  36. Refaat, A., et al. In vivo fluorescence imaging: success in preclinical imaging paves the way for clinical applications. J Nanobiotechnology. 20 (1), 450 (2022).
  37. Pirovano, G., Roberts, S., Kossatz, S., Reiner, T. Optical imaging modalities: Principles and applications in preclinical research and clinical settings. J Nucl Med. 61 (10), 1419-1427 (2020).
  38. Branchini, B. R., Southworth, T. L., Khattak, N. F., Michelini, E., Roda, A. Red- and green-emitting firefly luciferase mutants for bioluminescent reporter applications. Anal Biochem. 345 (1), 140-148 (2005).
  39. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10 (4), 041210 (2005).
  40. O’Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. Mennel, L., et al. A photosensor employing data-driven binning for ultrafast image recognition. Sci Rep. 12 (1), 14441 (2022).
  42. Yoo, Y., Im, J., Paik, J. Low-light image enhancement using adaptive digital pixel binning. Sensors. 15 (7), 14917-14931 (2015).
  43. Moraes, C. B., et al. Accelerating drug discovery efforts for trypanosomatidic infections using an integrated transnational academic drug discovery platform. SLAS Discov. 24 (3), 346-361 (2019).
  44. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharm Stat. 10 (2), 128-134 (2011).
  45. Kim, S., et al. PubChem 2023 update. Nucleic Acids Res. 51, D1373-D1380 (2023).
  46. Sharma, V., McNeill, J. H. To scale or not to scale: the principles of dose extrapolation. Br J Pharmacol. 157 (6), 907-921 (2009).
  47. Barrow, J. C., Lindsley, C. W. The importance of PK-PD. J Med Chem. 66 (7), 4273-4274 (2023).
  48. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  49. Lewis, M. D., Kelly, J. M. Putting infection dynamics at the heart of Chagas disease. Trends Parasitol. 32 (11), 899-911 (2016).
  50. Brener, Z. Therapeutic activity and criterion of cure on mice experimentally infected with Trypanosoma cruzi. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 4, 389-396 (1962).
  51. Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Mol Biochem Parasitol. 129 (1), 53-59 (2003).
  52. . Global BioImaging Available from: https://globalbioimaging.org (2024)
  53. Pfander, C., et al. Euro-BioImaging – Interdisciplinary research infrastructure bringing together communities and imaging facilities to support excellent research. iScience. 25 (2), 103800 (2022).

Tags

In Vivo Bioluminescence ImagingChagas DiseaseMouse ModelDrug Efficacy StudiesTrypanosoma CruziLuciferaseNeglected Tropical DiseasesParasite BiologyDisease PathogenesisResearch And DevelopmentIn Vitro And In Vivo Study ModelsQuality Control ProceduresData Acquisition And Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
da Silva, A. C., Kratz, J. M., Morgado, P. G. M., Freitas-Junior, L. H., Moraes, C. B. Demystifying In Vivo Bioluminescence Imaging of a Chagas Disease Mouse Model for Drug Efficacy Studies. J. Vis. Exp. (207), e66740, doi:10.3791/66740 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image