バイオハイブリッド型蚊取りを用いた原子間力顕微鏡プローブの開発
Summary
昆虫を噛む行動の定量的かつ制御された調査は、ベクター媒介性疾患と戦うための効果的な戦略を考案するために重要です。これに関連して、バイオハイブリッド原子間力顕微鏡(AFM)プローブを製造する方法が導入されます。
Abstract
蚊は、病気を媒介する能力があるため、人間にとって最も致命的な動物として悪名高く、公衆衛生に永続的な課題を提起しています。現在使用されている一次予防戦略には化学忌避剤が含まれますが、蚊が急速に耐性を発達させるため、効果がないことがよくあります。したがって、新しい予防方法の発明は非常に重要です。このような開発は、蚊に刺される行動を完全に理解することにかかっており、制御可能なテストパラメータと定量的測定を使用して実際の刺すシナリオを正確に再現する実験設定が必要です。このギャップを埋めるために、バイオハイブリッド原子間力顕微鏡(AFM)プローブが設計され、その先端として生物学的針(特に蚊の唇)が特徴付けられました。このバイオハイブリッドプローブは、標準的なAFMシステムと互換性があり、蚊の侵入挙動をほぼ本物に近いシミュレーションで実現します。この方法は、噛むメカニズムの定量的研究における一歩前進を示し、ベクター媒介性疾患(VBD)に対する効果的な障壁の作成につながり、蚊が媒介する病気との闘いに新たな道を開く可能性があります。
Introduction
世界保健機関(WHO)は、ベクター媒介性疾患(VBD)が全感染症の17%以上を占め、世界で年間70万人以上の死亡を引き起こしていると報告しました。例えば、世界で最も致命的な動物である蚊は、デング熱、マラリア、ジカ熱などの多くの病原体を、血液を媒介する節足動物を介して拡散させ、毎年7億件の感染をもたらしています1。蚊の侵入行動を模倣して蚊を刺すメカニズムを調べたり、侵入防止の有効性を証明するための潜在的な障壁の研究など、VBDを予防するための効果的な対策の開発に向けた探求は非常に重要です。重要な課題の1つは、そのような調査を実行するための適切なアプローチを開発することです。蚊の針の形状に似たマイクロスケールの針の開発など、文献で努力が払われてきました。しかし、これらのマイクロニードルを作るために使用される材料の多くは、粘弾性材料2、シリコン(Si)、ガラス、セラミック3など)は、蚊の吻の生物学的材料とは異なる機械的特性を持っています。設計された材料は脆く、破壊や座屈を起こしやすい可能性があります3,4が、蚊の吻は破壊や座屈によく耐えることができます4。人工材料の代わりに蚊の唇を使用するバイオハイブリッドプローブを持つことの利点は、蚊の穿刺メカニズムをより正確に表現できることです。また、力5の正確な測定など、定量的な研究を行うには、特殊なツールをマイクロニードルと統合する必要がありますが、これは、設計されたマイクロニードルを使用したカスタマイズされたセットアップでは簡単に達成できません。
原子間力顕微鏡(AFM)ベースのアプローチは、サンプルの表面近くに注意深く配置された超微細チップを備えたカンチレバーを採用することによって動作するという点で有望です。先端は、表面を横切ってスキャンするか、表面に向かって/押し込むことができ、サンプルとの相互作用により、さまざまな引力または反発力を受けます6。これらの相互作用は、カンチレバーの偏向につながり、カンチレバーの上部から光検出器6へのレーザービームの反射によって追跡される。システムの動きに対する並外れた感度により、AFMは、ピコメートル精度の形態学的マッピング、ピコニュートンからマイクロニュートンまでの力測定、包括的なマルチフィジックス調査7など、さまざまな測定を行うことができます。例えば、AFMインデンテーションは、試料に加えられた力に対する応答を正確に評価するために実行することができ、また、適切な分析モデル8と結合することによって、試料の硬度、弾性、およびその他の機械的特性を測定することができる。AFMのプローブは、最も一般的には、長さ20〜300μm9、先端半径が数〜数十ナノメートルのオーダー10のシリコン(Si)または窒化ケイ素(Si3N4)8でできています。ナノメートルスケールの先端半径は、高解像度イメージングなどのアプリケーションに最適です。ただし、剛性、半径、形状、およびアスペクト比の点で浸透動作を模倣しようとする研究用の生物学的針の特性はありません。例えば、蚊の微小針構造は束であり、そのアスペクト比は~6011(長さ~1.5mmから2mm、直径~30μm)12である。従来のAFMプローブは、唇のような生物学的な針に似ていると想定できますが、その明確な材料特性と寸法は、噛み合わせ中の実際の状況を反映していません。
昆虫などの生物咬傷を針で模倣した浸透挙動を定量的に調べるために、生物針を先端とするバイオハイブリッドAFM片持ち梁を作製するプロセスを開発した。ケーススタディとして、蚊の唇の先端が取り付けられたAFMカンチレバーのデモンストレーションに成功しました。蚊が犠牲者の皮膚を突き刺すために使用する典型的な挿入力に関する文献からの既存の情報を利用する12,13、このバイオハイブリッドAFMカンチレバーは、通常のAFMの下で蚊に刺された蚊のほぼ現実的な模倣を可能にする可能性があります。マイクロバイオバイオスティンガーを活用してバイオハイブリッドAFMカンチレバーを製造するプロトコルは、さまざまな噛み込みメカニズムの定量的研究のための他の鋭いスティンガーベースのバイオハイブリッドAFMカンチレバーの開発にも適用できます。
用語
吻とその関心のあるコンポーネントの概略図を図1に示し、それらの定義は、(1)テング:蚊が自分自身を養うことを可能にする蚊の口からの体の部分で、束(コア)と陰唇(シェル)で構成されるコアシェル構造、(2)陰唇:テング2の暗くて鈍い外側のカバー、(3)束:2つの上顎、2つの下顎、下咽頭、および唇を含む、陰唇の内側に含まれる細い針のグループ2、(4)下咽頭:宿主の血流に唾液を分泌する役割を果たします2、(5)上顎:摂食メカニズムを補助する鋸歯状のメンバー2、(5)下顎:上顎と同様に、摂食メカニズムで蚊を助け、鋭い先端2を持っています、(6)唇:上顎、下顎骨、下咽頭よりもはるかに大きい、犠牲者の皮膚を貫通するための主要なメンバー。また、皮膚の下の血管や内部チャネルを見つけることができる感覚構造も備えています2、 (7) マニピュレータ:位置決めのための3つの自由度とミクロンスケールの精度を備えたアセンブリで、XYZ方向への移動を可能にします (8) クランプアセンブリ : 実験中にチップレスAFMカンチレバーをクランプするために使用されるマニピュレータに取り付けられたカスタムメイドの2部構成クランプ。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルのステップ1は、不要な陰唇の生物学的サンプルを洗浄することを目的としています。これを達成するために、陰唇を切開しますが、陰唇の真下にある束には切開しません(図1)。束と陰唇はそれらの界面で結合されていないため(つまり、陰唇は束に沿って自由にスライドし、蚊の頭に付着することによってのみ所定の位置に保持されます)、実行された切開は?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、カナダの研究基金(NFRF)、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)ディスカバリープログラム、およびケベック自然技術財団(FRQNT)の修士課程のトレーニング奨学金からの資金援助を認めています。著者らはまた、いくつかのコンポーネントの3Dプリンティングに関する技術サポートを提供してくれたマギル大学のYaoyao Zhao教授のグループに感謝します。
Materials
| 5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers | Excelta | N/A | For manipulating/dissecting the proboscis. |
| C-4D Probe station | Everbeing Int’l Corp | N/A | Used for AFM assembly. |
| Tipless Tapping Mode Cantilever | NanoAndMore USA | TL-NCH | AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 – 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 – 497 kHz) Length: 125 µm (115 – 135 µm) Width: 30 µm (22.5 – 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 – 5 µm) |
| UV Expoxy | Let's resin | ALR00146 | For stinger attachment. |
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