פיתוח גשושית ביו-היברידית מבוססת מיקרוסקופ כוח אטומי מבוסס יתושים
Summary
מחקרים כמותיים ומבוקרים של התנהגויות עקיצת חרקים חיוניים לגיבוש אסטרטגיות יעילות למאבק במחלות המועברות על ידי וקטורים. בהקשר זה מוצגת שיטה לייצור מיקרוסקופ כוח אטומי ביו-היברידי (AFM).
Abstract
יתושים, הידועים לשמצה כבעלי החיים הקטלניים ביותר לבני אדם בשל יכולתם להעביר מחלות, מהווים אתגר מתמשך לבריאות הציבור. אסטרטגיית המניעה העיקרית הנמצאת בשימוש כיום כוללת חומרים דוחי כימיקלים, אשר לעתים קרובות מתגלים כלא יעילים מכיוון שיתושים מפתחים עמידות במהירות. כתוצאה מכך, המצאת שיטות מניעה חדשות היא חיונית. פיתוח כזה תלוי בהבנה מעמיקה של התנהגויות עקיצת יתושים, מה שמחייב מערך ניסויי שמשכפל במדויק תרחישי עקיצה אמיתיים עם פרמטרים של בדיקה נשלטת ומדידות כמותיות. כדי לגשר על פער זה, הונדס מיקרוסקופ כוח אטומי ביו-היברידי (AFM), הכולל עוקץ ביולוגי – במיוחד, לברום יתושים – כקצהו. בדיקה ביו-היברידית זו, התואמת למערכות AFM סטנדרטיות, מאפשרת סימולציה כמעט אותנטית של התנהגויות חדירת יתושים. שיטה זו מסמנת צעד קדימה במחקר הכמותי של מנגנוני עקיצה, מה שעשוי להוביל ליצירת מחסומים יעילים נגד מחלות המועברות על ידי וקטורים (VBDs) ולפתוח אפיקים חדשים במאבק במחלות המועברות על ידי יתושים.
Introduction
ארגון הבריאות העולמי (WHO) דיווח כי מחלות המועברות על ידי וקטורים (VBDs) מהוות מעל 17% מכלל המחלות הזיהומיות, הגורמות ליותר מ -7,00,000 מקרי מוות בשנה ברחבי העולם. לדוגמה, כחיה הקטלנית ביותר בעולם, יתושים מפיצים פתוגנים רבים, כגון דנגי, מלריה וזיקה, באמצעות פרוקי רגליים הניזונים מדם, וכתוצאה מכך 700 מיליון זיהומים מדי שנה1. מחקרים לקראת פיתוח אמצעים יעילים למניעת VBDs הם בעלי חשיבות מכרעת, כולל חיקוי התנהגויות החדירה של יתושים כדי לחקור את מנגנוני העקיצה שלהם ומחקרים על חסמים פוטנציאליים כדי להוכיח את יעילותם במניעת חדירה. אתגר מרכזי אחד הוא לפתח גישות מתאימות לביצוע חקירות כאלה. נעשו מאמצים בספרות, כולל פיתוח מחטים בקנה מידה זעיר הדומות לגיאומטריה של עוקץ יתושים; עם זאת, רבים מהחומרים המשמשים לייצור מיקרו-מחטים אלה (כלומר, חומרים ויסקו-אלסטיים2, סיליקון (Si), זכוכית, קרמיקה3 וכו ‘) הם בעלי תכונות מכניות שונות מאשר החומר הביולוגי של היתוש. החומרים המהונדסים יכולים להיות שבירים ונוטים לשבר ואבזמים 3,4, בעוד שחוטמו של היתוש יכול לעמוד בשבר או באבזם טוב יותר4. היתרון של בדיקה ביו-היברידית המשתמשת בלברום של יתוש במקום בחומרים מהונדסים הוא שהיא יכולה להיות ייצוג מדויק יותר של מנגנון הפירסינג של יתושים. כמו כן, יש לשלב כלים מיוחדים עם מחטי מיקרו לביצוע מחקרים כמותיים, כגון מדידה מדויקת של כוח5, שאינה ניתנת להשגה בקלות עם הגדרות מותאמות אישית באמצעות מיקרו-מחטים מהונדסות.
הגישה המבוססת על מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מבטיחה בכך שהיא פועלת על ידי שימוש במקל עם קצה דק במיוחד הממוקם בזהירות קרוב לפני השטח של הדגימה. הקצה יכול לסרוק לרוחב או להילחץ לכיוונ/לתוך משטח, חווה כוחות מושכים או דוחים משתנים עקב האינטראקציות שלו עם מדגם6. אינטראקציות אלה מובילות לסטייה של הקנטילבר, אשר עוקבת על ידי השתקפות של קרן לייזר מראש הקנטיליבר אל פוטו-גלאי6. הרגישות יוצאת הדופן לתנועה של המערכת מאפשרת ל-AFM לבצע מגוון רחב של מדידות, כולל, אך לא רק, מיפוי מורפולוגי בדיוק פיקומטר, מדידות כוח החל מפיקוניוטון ועד מיקרוניוטון, וחקירות מולטיפיזיקליות מקיפות7. לדוגמה, ניתן לבצע הזחות AFM כדי להעריך במדויק את התגובה לכוח המופעל של מדגם וגם כדי למדוד את הקשיות, האלסטיות ותכונות מכניות אחרות של מדגם על ידי צימוד עם מודלים אנליטיים מתאימים8. הגשושית של AFM עשויה לרוב מסיליקון (Si) או סיליקון ניטריד (Si3N4)8 באורך של 20-300 מיקרומטר9 ורדיוס קצה בסדר גודל של כמה עד עשרות ננומטרים10. רדיוס קצה קנה המידה הננומטרי יכול להיות אידיאלי עבור יישומים כגון הדמיה ברזולוציה גבוהה; עם זאת, אין לו את המאפיינים של עוקצים ביולוגיים למחקרים המנסים לחקות התנהגויות חדירה במונחים של נוקשות, רדיוס, צורה ויחס גובה-רוחב. לדוגמה, מבנה המיקרו-מחט של יתוש הוא הפשיקל, שיש לו יחס גובה-רוחב של ~6011 (אורך ~ 1.5 מ”מ עד 2 מ”מ; קוטר ~ 30 מיקרומטר)12. בעוד שניתן להניח שגשושית AFM קונבנציונלית דומה לעקיצות ביולוגיות כמו לברום, התכונות והממדים החומריים הייחודיים שלה לא ישקפו את המצב האמיתי במהלך נשיכה.
כדי לאפשר חקירה כמותית של התנהגויות חדירה המחקות עקיצות ביולוגיות של חרקים או בעלי חיים אחרים עם עוקץ, כאן מפותח תהליך לייצור מכלי AFM ביו-היברידיים עם עוקץ ביולוגי כקצהו. כמקרה בוחן, הודגם בהצלחה מקל AFM עם קצה לברום יתוש מחובר. תוך רתימת מידע קיים מהספרות על כוחות ההחדרה האופייניים שיתוש משתמש בהם כדי לחדור דרך עורו של קורבן12,13, AFM ביו-היברידי זה יכול לאפשר חיקוי כמעט אמיתי של עקיצות יתושים תחת AFM רגיל. הפרוטוקול של מינוף עוקצים מיקרו-ביולוגיים לייצור מיכלי AFM ביו-היברידיים יכול להיות מיושם גם בפיתוח של מכלי AFM ביו-היברידיים חדים אחרים מבוססי עוקץ חד לחקירות כמותיות של מגוון מנגנוני נשיכה.
טרמינולוגיות
סכמה של חוטם ומרכיבי העניין שלו מוצגים באיור 1, וההגדרות שלהם הן: (1) פרובוסקיס: חלק גוף מפיו של יתוש המאפשר ליתוש להאכיל את עצמו, עם מבנה של קליפת ליבה המורכב מהפשקוויל (הליבה) והלאביום (קונכייה), (2) לאביום: הכיסוי החיצוני הכהה והקהה של חוטם2, (3) פשקוויל: קבוצה של מחטים דקות הכלולות בתוך הלביום, כולל שתי מקסילות, שתי לסתות, היפופרינקס ולברום2, (4) היפופרינקס: אחראי על הפרשת רוק למחזור הדם של הפונדקאי2, (5) מקסילה: חבר משונן המסייע במנגנון ההזנה2, (5) מנדבלים: בדומה למקסילה, הם מסייעים ליתוש במנגנון ההזנה ויש להם קצה חד2, (6) לברום: האיבר העיקרי לחדירה לעור הקורבן, שהוא הרבה יותר גדול מהמקסילה, הלסת התחתונה וההיפופרינקס. יש לו גם מבנים חושיים המאפשרים לו למצוא כלי דם ותעלות פנימיות מתחת לעור2, (7) מניפולטור: הרכבה עם שלוש דרגות חופש ודיוק בקנה מידה מיקרוני למיקום, המאפשר תנועה בכיווני XYZ, (8) הרכבת מהדק: מהדק 2 חלקים בהתאמה אישית המורכב על המניפולטור המשמש להידוק ה- AFM חסר הקצה במהלך הניסוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלב 1 של הפרוטוקול נועד לנקות את הדגימה הביולוגית של הלביום הלא רצוי. כדי להשיג זאת, מבצעים חתך על הלביום, אבל לא על הפשקוויל, שנמצא ישירות מתחת ללאביום (איור 1). מכיוון שהפאשיל והלביום אינם מחוברים זה לזה בממשק שלהם (כלומר, הלביום חופשי להחליק לאורך הפאשקוויל ונשמר במקומו רק ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים על תמיכת המימון של קרן הגבולות החדשים במחקר של קנדה (NFRF), תוכנית גילוי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC), ומלגות ההכשרה לתואר שני Fonds de Recherche du Québec Nature et Technologies (FRQNT). המחברים גם רוצים להודות לקבוצתו של פרופ’ יאויאו ז’או במקגיל על תמיכתם הטכנית בהדפסה תלת-ממדית של רכיבים מסוימים.
Materials
| 5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers | Excelta | N/A | For manipulating/dissecting the proboscis. |
| C-4D Probe station | Everbeing Int’l Corp | N/A | Used for AFM assembly. |
| Tipless Tapping Mode Cantilever | NanoAndMore USA | TL-NCH | AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 – 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 – 497 kHz) Length: 125 µm (115 – 135 µm) Width: 30 µm (22.5 – 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 – 5 µm) |
| UV Expoxy | Let's resin | ALR00146 | For stinger attachment. |
References
- World Health Organization. Global vector control response 2017–2030. World Health Organization. , (2017).
- Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. Lessons from mosquitoes’ painless piercing. J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).
- Ma, G., Wu, C. Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review. Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).
- Kong, X., Wu, C. Micronano structure and mechanics behavior of mosquito’s proboscis biomaterials with applications to microneedle design. Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).
- Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement. Sci Rep. 10 (1), 12248 (2020).
- Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. Introduction to Scanning Probe Microscopy. Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).
- García, R., Peréz, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
- Thurner, P. J. Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone. WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).
- Müller, D. J., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).
- Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology. Meas Sci Technol. 28 (1), 012001 (2017).
- Kong, X. Q., Wu, C. W. Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system. Phys Rev E. 82 (1), 011910 (2010).
- Kong, X. Q., Wu, C. W. Measurement and prediction of insertion force for the mosquito. J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).
- Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design. Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001 (2008).
- Dai, G., et al. Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures. Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).
