Paradigmas para Avaliação Comportamental no Modelo de Drosophila de Transtorno do Espectro do Autismo

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) engloba um grupo heterogêneo de distúrbios neurológicos. Inclui uma série de distúrbios complexos do neurodesenvolvimento caracterizados por déficits multicontextuais e persistentes na comunicação social e interação social e a presença de padrões e interesses comportamentais e de atividade restritos e repetitivos¹. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), 1 em cada 100 crianças é diagnosticada com TEA em todo o mundo, com uma proporção de homens para mulheres de 4,2². A doença torna-se evidente no segundo ou terceiro ano de vida. Crianças com TEA mostram falta de interesse em reciprocidade socioemocional, comunicação não verbal e habilidades de relacionamento. Eles exibem comportamentos repetitivos, como movimento motor estereotipado, rotina inflexível e ritualizada e foco intenso em interesses restritos. Crianças com TEA apresentam um alto grau de resposta ao toque, olfato, som e paladar, enquanto a resposta à dor e à temperatura é comparativamente baixa¹. A penetrância desse distúrbio também é diferente entre diferentes pacientes que sofrem de TEA e, portanto, a variabilidade aumenta.

O diagnóstico clínico atual de TEA é baseado na avaliação comportamental dos indivíduos, pois não há teste genético comum ou baseado em biomarcadores confirmatório que cubra todas as formas de TEA³. Decifrar as bases genéticas e neurofisiológicas seria útil para direcionar estratégias de tratamento. Na última década, um grande corpo de pesquisa resultou na identificação de centenas de genes que são excluídos ou mutados ou cujos níveis de expressão são alterados em pacientes com TEA. Pesquisas em andamento enfatizam a validação da contribuição desses genes candidatos usando organismos modelo como o camundongo ou a mosca-da-fruta, nos quais esses genes são nocauteados ou derrubados, seguidos por testes para déficits comportamentais semelhantes ao TEA e elucidação das vias genéticas e moleculares subjacentes que causam as anomalias. Um modelo de camundongo recapitulando as variações do número de cópias (CNVs) nos loci cromossômicos humanos 16p11.2 mostra alguns dos defeitos comportamentais do TEA ^4,5,6. A exposição pré-natal a um medicamento teratogênico ácido valpróico (VPA) é outro modelo de camundongo que descreve características semelhantes ao TEA humano ^7,8. Além disso, existe uma variedade de modelos de camundongos que exibem autismo associado à síndrome genética, por exemplo, modelos sindrômicos de gene único causados por mutações em Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c e modelos não sindrômicos de gene único causados por mutações em genes como Cntnap2, Shank, Neurexin ou genes Neuroligin ⁵.

A mosca-da-fruta (Drosophila melanogaster) é outro organismo modelo proeminente para estudar as bases celulares, moleculares e genéticas de uma infinidade de doenças humanas⁹, incluindo TEA. Drosophila e humanos compartilham processos biológicos altamente conservados nos níveis molecular, celular e sináptico. As moscas-das-frutas têm sido usadas com sucesso em estudos de TEA^{10 , 11 , 12} para caracterizar genes ligados a TEAs e decifrar seu papel exato na sinaptogênese, função sináptica e plasticidade, montagem do circuito neural e maturação; descobriu-se que os homólogos de moscas de genes associados ao TEA têm papéis na regulação do comportamento social e / ou repetitivo 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. A mosca-da-fruta também tem funcionado como modelo para a triagem de genes de TEA e suas variantes 15,22,23. O maior desafio na pesquisa de TEA em moscas é que, ao contrário de outros modelos de doenças, não existe um único modelo de mosca com TEA. Para entender o impacto das mutações ou da derrubada de um gene específico do TEA, um pesquisador precisa validar se os fenótipos comportamentais imitam suficientemente os sintomas de pacientes com TEA e, em seguida, prosseguir para a compreensão dos fundamentos moleculares ou fisiológicos dos fenótipos.

Portanto, a detecção de fenótipos semelhantes ao TEA é vital para a pesquisa de TEA no modelo de mosca. Um punhado de técnicas comportamentais surgiu ao longo dos anos que nos permite detectar anormalidades como déficits no comportamento / interação social, comunicação, comportamentos repetitivos e capacidade de resposta a estímulos. Além disso, várias modificações e atualizações dessas técnicas comportamentais foram feitas em diferentes laboratórios para atender a requisitos específicos, como upscaling, automação de ensaios, leituras, quantificação e métodos de comparação. Neste artigo em vídeo, são demonstradas as versões mais básicas de cinco paradigmas comportamentais, que, em combinação, podem ser usados para detectar resultados comportamentais semelhantes ao TEA da maneira mais fácil.

A agressão é um comportamento inato evolutivamente conservado que afeta a sobrevivência e a reprodução²⁴. O comportamento agressivo em relação aos coespecíficos é influenciado pela ‘motivação para a ^{socialização’25,26} e pela ‘^{comunicação’27}, ambos comprometidos em indivíduos afetados por TEA. O comportamento agressivo é bem descrito em Drosophila e sua quantificabilidade através do robusto ensaio de agressão 28,29,30 e uma base genética e neurobiológica bem compreendida ³¹ o torna um paradigma comportamental adequado³² para avaliar o fenótipo ASD em um modelo de mosca. A agressão é afetada pelo isolamento social longe de um ambiente social, o que leva a uma agressão aumentada; O mesmo foi observado quando as moscas machos são alojadas em isolamento por alguns dias^33,34. Outro ensaio comportamental que quantifica a sociabilidade em moscas é o Social Space Assay³⁵, que mede as distâncias entre os vizinhos mais próximos e as distâncias entre moscas em um pequeno grupo de moscas, tornando-o perfeitamente adequado para testar os papéis dos ortólogos do gene ASD na mosca 12,21,36,37, bem como modelos de moscas ASD induzidos pelo ambiente^{38, 39}.

O ensaio de namoro de Drosophila é outro paradigma comportamental frequentemente usado para testar a alteração nas habilidades sociais e de comunicação em circuito ou manipulação genética, incluindo genes relacionados ao autismo 18,19,21,40. Padrões repetitivos de comportamento são prevalentes em pacientes com TEA, que são recapitulados em moscas pelo comportamento de higiene – uma série de ações distintas e estereotipadas realizadas para limpeza e outros propósitos. Ele tem sido usado com sucesso para testar o impacto de mutações no gene ASD em moscas^21,41, bem como a exposição a produtos químicos ^38,39. Vários avanços e automação no ensaio foram descritos antes 16,41,42,43; Aqui, estamos demonstrando o padrão de ensaio mais básico, que é fácil de adotar e quantificar.

Sabe-se que o TEA afeta a capacidade de habituação, aprendizado e memória em alguns pacientes 44,45,46,47,48,49,50, organismos modelo de TEA ^51,52 e também causa déficits em diferentes comportamentos olfativos⁵⁰. A habituação de salto light-off de Drosophila foi usada anteriormente para rastrear genes ASD²³. A habituação pode ser testada por um método simples de ensaio de habituação olfativa 53,54,55. Descrevemos o método para induzir a habituação olfativa e analisamos o resultado usando um ensaio clássico de escolha de odor binário baseado em labirinto^{em Y 56} que pode ser usado para detectar defeitos na habituação no gene ASD mutante ou na condição de knockdown do gene. Para avaliar se o impacto de uma mutação (ou knock-down de genes) ou de um tratamento farmacológico no comportamento de uma mosca equivale a um fenótipo semelhante ao TEA, pode-se usar uma combinação desses 5 ensaios descritos aqui.