Paradigmi per la valutazione comportamentale nel modello di Drosophila del disturbo dello spettro autistico

Il Disturbo dello Spettro Autistico (ASD) comprende un gruppo eterogeneo di disturbi neurologici. Comprende una serie di disturbi complessi del neurosviluppo caratterizzati da deficit multicontestuali e persistenti nella comunicazione e nell’interazione sociale e dalla presenza di modelli comportamentali e di attività ristretti e ripetitivi e interessi¹. Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), a 1 bambino su 100 viene diagnosticato l’ASD in tutto il mondo con un rapporto maschi/femmine di 4,2². La malattia si manifesta nel secondo o terzo anno di vita. I bambini con ASD mostrano una mancanza di interesse per la reciprocità socio-emotiva, la comunicazione non verbale e le capacità relazionali. Esibiscono comportamenti ripetitivi come il movimento motorio stereotipato, il seguire la routine inflessibile e ritualizzata e un’intensa attenzione agli interessi ristretti. I bambini con ASD mostrano un alto grado di risposta al tatto, all’olfatto, al suono e al gusto, mentre la risposta al dolore e alla temperatura è^{relativamente bassa.} Anche la penetranza di questo disturbo è diversa tra i diversi pazienti affetti da ASD e quindi la variabilità aumenta.

L’attuale diagnosi clinica di ASD si basa sulla valutazione comportamentale degli individui in quanto non esiste un test genetico comune basato su biomarcatori di conferma che copra tutte le forme di ASD³. Decifrare le basi genetiche e neurofisiologiche sarebbe utile per indirizzare le strategie di trattamento. Nell’ultimo decennio, un ampio corpus di ricerche ha portato all’identificazione di centinaia di geni che sono stati eliminati o mutati o i cui livelli di espressione sono alterati nei pazienti con ASD. La ricerca in corso enfatizza la convalida del contributo di questi geni candidati utilizzando organismi modello come il topo o il moscerino della frutta, in cui questi geni vengono eliminati o abbattuti, seguiti da test per deficit comportamentali simili all’ASD e chiarimenti dei percorsi genetici e molecolari sottostanti che causano le anomalie. Un modello murino che ricapitola le variazioni del numero di copie (CNV) nei loci cromosomici umani 16p11.2 mostra alcuni dei difetti comportamentali dell’ASD ^4,5,6. L’esposizione prenatale a un farmaco teratogeno, l’acido valproico (VPA) è un altro modello murino che raffigura tratti simili all’ASD ^7,8 umano. Inoltre, esiste una serie di modelli murini che mostrano autismo associato alla sindrome genetica, ad esempio, modelli sindromici a singolo gene causati da mutazioni in Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c e modelli non sindromici a singolo gene causati da mutazioni in geni come Cntnap2, Shank, Neurexin o Neuroligin ⁵.

Il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) è un altro importante organismo modello per lo studio delle basi cellulari, molecolari e genetiche di una pletora di malattie umane⁹, tra cui l’ASD. La Drosophila e l’uomo condividono processi biologici altamente conservati a livello molecolare, cellulare e sinaptico. I moscerini della frutta sono stati utilizzati con successo negli studi sull’ASD 10,11,12 per caratterizzare i geni legati agli ASD e decifrare il loro ruolo esatto nella sinaptogenesi, nella funzione sinaptica e nella plasticità, nell’assemblaggio dei circuiti neurali e nella maturazione; Si è scoperto che gli omologhi dei geni associati all’ASD hanno un ruolo nella regolazione del comportamento sociale e/o ripetitivo 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Il moscerino della frutta ha anche funzionato come modello per lo screening dei geni ASD e delle loro varianti 15,22,23. La sfida più grande nella ricerca sull’ASD nei moscerini è che, a differenza di altri modelli di malattia, non esiste un unico modello di mosca ASD. Per comprendere l’impatto delle mutazioni o dell’abbattimento di uno specifico gene ASD, un ricercatore deve convalidare se i fenotipi comportamentali imitano sufficientemente i sintomi dei pazienti con ASD e quindi procedere verso la comprensione delle basi molecolari o fisiologiche dei fenotipi.

Pertanto, il rilevamento di fenotipi ASD-like è vitale per la ricerca sull’ASD nel modello di mosca. Nel corso degli anni sono emerse una manciata di tecniche comportamentali che ci consentono di rilevare anomalie come deficit nel comportamento/interazione sociale, comunicazione, comportamenti ripetitivi e reattività agli stimoli. Inoltre, diverse modifiche e aggiornamenti di queste tecniche comportamentali sono stati apportati in diversi laboratori per soddisfare requisiti specifici come l’upscaling, l’automazione dei saggi, le letture, la quantificazione e i metodi di confronto. In questo articolo video, vengono dimostrate le versioni più basilari di cinque paradigmi comportamentali che, in combinazione, possono essere utilizzati per rilevare gli esiti comportamentali simili all’ASD nel modo più semplice.

L’aggressività è un comportamento innato conservato evolutivamente che influenza la sopravvivenza e la riproduzione²⁴. Il comportamento aggressivo nei confronti dei conspecifici è influenzato dalla “motivazione alla socializzazione”^25,26 e dalla “comunicazione”²⁷, entrambi compromessi negli individui affetti da ASD. Il comportamento aggressivo è ben descritto in Drosophila e la sua quantificabilità attraverso il robusto saggio di aggressività 28,29,30 e una base genetica e neurobiologica ben compresa³¹ lo rende un paradigma comportamentale adatto ³² per valutare il fenotipo ASD in un modello di mosca. L’aggressività è influenzata dall’isolamento sociale lontano da un ambiente sociale, che porta a una maggiore aggressività; Lo stesso è stato osservato quando i moscerini maschi sono alloggiati in isolamento per alcuni giorni^33,34. Un altro test comportamentale che quantifica la socievolezza nei moscerini è il Social Space Assay³⁵, che misura le distanze tra i vicini più prossimi e le distanze tra i moscerini in un piccolo gruppo di mosche, rendendolo perfettamente adatto per testare i ruoli degli ortologhi del gene ASD nei moscerini 12,21,36,37 e nei modelli di mosche ASD indotti dall’ambiente ^{38. 39}.

Il test di corteggiamento della Drosophila è un altro paradigma comportamentale frequentemente utilizzato per analizzare l’alterazione delle abilità sociali e comunicative su circuito o manipolazione genetica, compresi i geni correlati all’autismo 18,19,21,40. I modelli di comportamento ripetitivi sono prevalenti nei pazienti con ASD, che si ricapitola nelle mosche con il comportamento di toelettatura, una serie di azioni distinte e stereotipate eseguite per la pulizia e altri scopi. È stato utilizzato con successo per valutare l’impatto delle mutazioni del gene ASD nei moscerini^21,41 e l’esposizione a sostanze chimiche ^38,39. Molteplici avanzamenti e automazione nel saggio sono stati descritti prima del 16,41,42,43; In questo articolo, stiamo dimostrando il modello di analisi più semplice, che è facile da adottare e quantificare.

È noto che l’ASD influisce sulla capacità di assuefazione, apprendimento e memoria in alcuni pazienti 44,45,46,47,48,49,50, organismi modello ASD ^51,52 e causa anche deficit in diversi comportamenti olfattivi⁵⁰. L’abitudine al salto a luci spente di Drosophila è stata utilizzata in precedenza per lo screening dei geni ASD²³. L’assuefazione può essere valutata con un semplice metodo di saggio di assuefazione olfattiva 53,54,55. Descriviamo il metodo per indurre l’assuefazione olfattiva e saggiamo il risultato utilizzando un classico saggio binario di scelta dell’odore basato sul labirinto a Y⁵⁶ che può essere utilizzato per rilevare difetti nell’assuefazione in condizioni di mutazione del gene ASD o knockdown genico. Per valutare se l’impatto di una mutazione (o di un gene knock-down) o di un trattamento farmacologico sul comportamento di una mosca equivalga a un fenotipo ASD-like, si può utilizzare una combinazione di questi 5 saggi descritti qui.