Trombositlerde Süperoksit Anyon Oluşumunun Tespiti için Alternatif Yöntemler
Summary
Süperoksit anyonunun oluşumu, trombositlerin uyarılması için gereklidir ve düzensiz ise trombotik hastalıklar için kritik öneme sahiptir. Burada, süperoksit anyonlarının seçici tespiti ve redoksa bağımlı trombosit regülasyonunun incelenmesi için üç protokol sunuyoruz.
Abstract
Reaktif oksijen türleri (ROS), oldukça kararsız oksijen içeren moleküllerdir. Kimyasal kararsızlıkları onları son derece reaktif hale getirir ve onlara proteinler, nükleik asitler ve lipitler gibi önemli biyolojik moleküllerle reaksiyona girme yeteneği verir. Süperoksit anyonları, moleküler oksijen indirgenmesinin indirgenmesiyle (yani bir elektronun elde edilmesi) üretilen önemli ROS’lardır. İlk başta yalnızca yaşlanma, dejeneratif ve patojenik süreçlerdeki etkilerine rağmen, önemli fizyolojik tepkilere katılımları son zamanlarda belirgin hale gelmiştir. Vasküler sistemde, süperoksit anyonlarının vasküler düz kas hücrelerinin farklılaşmasını ve fonksiyonunu, anjiyogenezde vasküler endotel hücrelerinin proliferasyonunu ve göçünü, immün yanıtı ve hemostazda trombositlerin aktivasyonunu modüle ettiği gösterilmiştir. Süperoksit anyonlarının rolü, trombositlerin düzensizliğinde ve kanser, enfeksiyon, iltihaplanma, diyabet ve obezite dahil olmak üzere çok sayıda durumla ilişkili kardiyovasküler komplikasyonlarda özellikle önemlidir. Bu nedenle, insan trombositleri tarafından süperoksit anyonlarının oluşumunu etkili bir şekilde ölçebilmek, hemostaz ve tromboz arasındaki dengeyi düzenleyen redoks bağımlı mekanizmaları anlayabilmek ve nihayetinde tromboz ve kardiyovasküler komplikasyonlara yol açan trombosit yanıtlarının modülasyonu için yeni farmakolojik araçları tanımlayabilmek kardiyovasküler araştırmalarda son derece önemli hale gelmiştir. Bu çalışma, trombositlerdeki süperoksit anyonlarının tespiti ve hemostaz ve trombozu düzenleyen redoks bağımlı mekanizmaların incelenmesi için başarıyla benimsenen üç deneysel protokol sunmaktadır: 1) akış sitometrisi ile dihidroetidyum (DHE) bazlı süperoksit anyon tespiti; 2) Tek trombosit görüntüleme ile DHE bazlı süperoksit anyon görselleştirme ve analizi; ve 3) elektron paramanyetik rezonans (EPR) ile trombositlerdeki süperoksit anyon çıkışının spin probu tabanlı miktar tayini.
Introduction
Süperoksit anyonu (O2 • –), trombositler1’de üretilen işlevsel olarak en ilgili ROS’tur. O2 • – moleküler oksijenin indirgenmesinin ürünü ve birçok farklı ROS 2’nin öncüsüdür. O2 • – ‘nin dismutasyonu, sulu çözeltideki spontan reaksiyonlar veya süperoksit dismutazlar (SOD’ler3) tarafından katalize edilen reaksiyonlar yoluyla hidrojen peroksit (H2O2) oluşumuna yol açar. Farklı enzimatik kaynaklar önerilmiş olsa da (örneğin, ksantin oksidaz4, lipoksijenaz5, siklooksijenaz6 ve nitrik oksit sentaz7), mitokondriyal solunum 8,9 ve nikotinamid adenin dinükleotid fosfat-oksidazlar (NOX’ler)10 ökaryotik hücrelerde en belirgin süperoksit anyonu kaynaklarıdır. Bu aynı zamanda, mitokondriyal solunumdan(11,12) elektron sızıntısının ve NOX’lerin13,14 enzimatik aktivitesinin, süperoksit anyon çıkışına ana katkıda bulunanlar olarak tanımlandığı trombositlerde de geçerli gibi görünmektedir.
Her ne kadar birkaç çalışma trombositlerin O2 • – tarafından düzenlenmesine odaklanmış olsa da, sorumlu moleküler mekanizmalar konusunda bir fikir birliği yoktur. Farklı trombosit reseptörleri için doğrudan oksidasyon ve disülfid bağı oluşumu yoluyla yüzey reseptör aktivitesinin modülasyonu önerilmiştir. Sistein kalıntılarının doğrudan oksidasyonu yoluyla integrin αIIbβ3’ün ROS tarafından pozitif regülasyonu önerilmiştir 15,16,17. Benzer şekilde, kollajene trombosit yanıtları, disülfide bağımlı dimerizasyona ve bunun sonucunda glikoprotein VI’nın (GPVI) 18 dimerizasyonuna bağlı olduğundan, deneysel olarak tam olarak kanıtlanmamış olsa da, ROS’a bağlı oksidasyon ile reseptör aktivitesi güçlendirmesi önerilmiştir19. Son olarak, glikoprotein Ib’nin (GPIb) sülfhidril gruplarının ROS ile indüklenen oksidasyonunun, inflamasyon20 sırasında trombosit yapışmasını ve trombosit-lökosit etkileşimini teşvik ettiği gösterilmiştir. Tersine, azalmış sülfhidril grubu oksidasyonu ve reseptör aktivasyonunun olası bir sonucu olarak, hem GPVI hem de GPIb’nin ektodomaininin dökülmesi, koşullarınazaltılmasıyla azalır 21.
Trombosit yüzey reseptörlerinin doğrudan oksidasyonundan bağımsız olarak etki modları da önerilmiştir. O2 • – dahil olmak üzere ROS’un, bu reseptörün22 sinyal kaskadını negatif olarak düzenleyen Src homoloji bölgesi 2 içeren protein tirozin fosfataz 2’nin (SHP-2) aktivitesini zayıflatarak kollajen reseptörü GPVI’yı pozitif olarak modüle ettiği gösterilmiştir. Ayrıca, O2 • – nitrik oksit (NO) ile hızlı reaksiyon yoluyla ONOO– (peroksinitrit) üretebilir, bu da normalde NO’ya duyarlı guanilil siklaz (NO-GC) yoluyla trombositleri inhibe eder ve negatif trombosit düzenleyici siklik GMP’nin (cGMP) oluşumunu engeller23,24. NO seviyelerinde ortaya çıkan azalma trombosit potansiyasyonuna yol açabilir. Alternatif olarak, NOX2 ile O 2 • – oluşumunun, trombosit aktivasyonu ve yapışma25 için gerekli olan lipid peroksidasyonuna ve izoprostan oluşumuna katkıda bulunduğu öne sürülmüştür. Son olarak, mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) hücre dışı sinyal regüle kinaz 5 (ERK5), trombositlerde26 redoks stres sensörü olarak önerilen bir protein kinaz, O2 • – tarafından aktive edilir ve trombositlerde bir prokoagülan fenotipi indükler (fosfatidilserin dışsallaştırmasının akış sitometrisi tabanlı ölçümü ile tahmin edildiği gibi)27.
Trombositlerde O2 • – ve diğer ROS oluşumunun düzensizliği, ateroskleroz, diabetes mellitus, hipertansiyon, obezite ve kanser ile ilişkili trombotik kardiyovasküler komplikasyonlara yol açan abartılı hemostatik yanıt ile ilişkilendirilmiştir28,29. Bu patolojik ortamlarda, trombositler tarafından ROS çıkışı artar, bu da yapışkan ve agregatör yanıtlarının güçlenmesine yol açar. Trombosit yanıtları üzerindeki etkisine ek olarak, trombositlerin serbest radikal çıkışının diğer kan hücreleri ve vasküler yapılar üzerinde sonuçları olabilir, bu da kardiyovasküler sağlığın yeterince anlaşılmamış ve yeterince araştırılmamış bir alanıdır30. Oksidatif stresi trombotik durumlara bağlayan moleküler mekanizmalar hakkındaki sınırlı anlayışımıza rağmen, kardiyovasküler hastalıklara karşı korunmada antioksidanların klinik önemi büyük ilgi görmüştür. Plazma antioksidan seviyelerinin kardiyovasküler rahatsızlıklar geliştirme riski ile ters orantılı olduğu gösterilmiştir ve diyetle antioksidan tüketiminin koroner arter hastalığına karşı koruma sağladığı gösterilmiştir31,32. Sonuç olarak, diyetle alınan antioksidanların kullanımı kardiyovasküler hastalıkların önlenmesi için umut verici bir yaklaşım olarak savunulmuştur 33,34,35. Trombositlerde ROS oluşumunun etkileri arasında, apoptozdaki artışın önemli patofizyolojik etkileri olabilir36,37. Genel olarak, trombositler tarafından O2 • – çıktısını tespit etmek ve ölçmek için güvenilir protokoller kardiyovasküler araştırmalarda giderek daha fazla önem kazanmaktadır.
Şu anda, ROS’un tespiti için mevcut teknikler, özgüllük (yani, tespit edilen oksidan moleküllerinin kimyasal doğası bilinmemektedir) ve güvenilirlik (yani, biyolojik moleküller ve deneysel reaktifler ile istenmeyen etkileşim, önyargılı fizyolojik olmayan sonuçlara yol açmaktadır) önemli sınırlamalara sahiptir38,39. Trombositlerde ROS’un saptanması için en yaygın olarak kullanılan yaklaşım, hücre içi esterazlar tarafından diklorodihidrofloreseine (DCFH) ve sonuç olarak hidroksil radikalleri ve peroksida-H2O2 ara ürünleri dahil olmak üzere hücresel oksidanlar tarafından yüksek floresan diklorofloreseine (DCF) dönüştürülen diklorodihidrofloresein diasetat (DCFDA) kullanımına dayanmaktadır40,41. Geniş kullanımına rağmen, hücre içi ROS38 ölçümü için bu yaklaşımın güvenilirliği ile ilgili ciddi sorular gündeme gelmiştir. DCFH’nin DCF’ye oksidasyonu, aslında, ROS42 yerine geçiş metali iyonları (örneğin, Fe2 +) veya hem içeren enzimler (örneğin, sitokromlar) tarafından indüklenebilir. Ayrıca, DCFDA, hücre peroksidazları tarafından semikinon serbest radikal formuna (DCF • –) dönüştürülür, bu da moleküler oksijen (O2 ) ile reaksiyona girerek DCF’ye oksitlenir ve O2 • – salınımı ile oksidatif reaksiyonların yapay amplifikasyonuna yol açar 41,43,44. Bu nedenle, hücre içi ROS’un DCFDA tarafından saptanması, ilk içgörüleri elde etmek için yararlıdır, ancak dikkatli bir değerlendirme ve kapsamlı deneysel kontroller gerektirir38,39.
Bu çalışma, O2•-1 trombosit fonksiyonunun anahtar düzenleyicisinin tespiti ve ölçümü için üç alternatif teknik sunmaktadır. İlk teknik, DCFDA’ya göre güvenilirlik ve özgüllük avantajları sunan DHE ve akış sitometrisi kullanılarak yapılan tespittir. Burada önerilen ikinci teknik de DHE’yi kullanır, ancak tespit yöntemi, hızlı kinetik ve tek hücre çözünürlüğü ile trombosit sinyalizasyonu üzerine O2 • – oluşumunun incelenmesine izin veren canlı trombosit floresan görüntülemedir. Son olarak, EPR rezonans deneylerinde hidroksilamin spin probu 1-hidroksi-3-metoksikarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirolidin (CMH) kullanımına dayanan bir protokol, trombositler tarafından O2 • – oluşum oranını ölçme ve farklı koşullarda karşılaştırma imkanı sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, O2 • –‘nin seçici tespiti yoluyla trombosit fonksiyonunun redoksa bağlı regülasyonunu araştırma yeteneğini geliştirme potansiyeline sahip üç farklı teknik sunuyoruz. İlk iki yöntem, kullanılan redoks probu (daha yaygın ancak daha az güvenilir DCFDA yerine DHE) nedeniyle mevcut tekniklerde bir gelişmedir. Bu nedenle, bu tekniklere kolayca erişilebilir ve çoğu laboratuvar, belirli ekipman veya eğitim maliyetleri olmadan bu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, İngiliz Kalp Vakfı (PG / 15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) ve Avrupa Araştırma Konseyi (#10102507) tarafından G. Pula’ya verilen hibelerle finanse edilmiştir.
Materials
| 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-02.1-50mg | Reagent for EPR (spin probe) |
| BD FACSAria III | BD Biosciences | NA | Flow cytometer |
| Bovine Serum Albumin | Merck/Sigma | A7030 | For μ-slide coating |
| Bruker E-scan M (Noxyscan) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-E.11-BES | EPR spectrometer |
| Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.) | Merck/Sigma | C4963 | Hydrogen peroxide scavenger (specificity control) |
| ChronoLog Model 490+4 | Labmedics/Chronolog | NA | Aggregometer |
| CM radical | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-20.1-100mg | Reagent for EPR (calibration control) |
| deferoxamine | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-09.1-100mg | Reagent for EPR |
| diethyldithiocarbamate (DETC) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-10.1-1g | Reagent for EPR |
| Dihydroethidium | Thermo Fisher Scientifics | D11347 | Superoxide anion probe |
| Dimethyl sulfoxide | Merck/Sigma | 34869 | For stock solution preparation |
| EPR sealing wax plates | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-A.3-VPM | Consumable for EPR |
| EPR-grade water | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-07.7.1-0.5L | Reagent for EPR |
| Fibrinogen from human plasma | Merck/Sigma | F4883 | For μ-slide coating |
| FITC anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303704 | Platelet-specific staining for flow cytometry |
| Glass cuvettes | Labmedics/Chronolog | P/N 312 | Consumable for incubation in aggregometer |
| Horm Collagen | Labmedics/Chronolog | P/N 385 | For platelet stimulation |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | NA | ImageJ 1.53t (Wayne Rasband) |
| Indomethacin | Merck/Sigma | I7378 | For platelet isolation |
| Micropipettes DURAN 50µl | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-G.6.1-50µL | Consumable for EPR |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Merck/Sigma | P2658 | For μ-slide coating |
| Prostaglandin E1 (PGE1) | Merck/Sigma | P5515 | For platelet isolation |
| Sodium citrate (4% w/v solution) | Merck/Sigma | S5770 | For platelet isolation |
| Stirring bars (Teflon-coated) | Labmedics/Chronolog | P/N 313 | Consumable for incubation in aggregometer |
| Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD) | Merck/Sigma | S9549 | Superoxide anion scavenger (specificity control) |
| Thrombin from human plasma | Merck/Sigma | T6884 | For platelet stimulation and μ-slide coating |
| VAS2870 | Enzo Life Science | BML-EI395 | NOX inhibitor |
| Zeiss 510 LSM confocal microscope | Zeiss | NA | Confocal microscope |
References
- Vara, D., Cifuentes-Pagano, E., Pagano, P. J., Pula, G. A novel combinatorial technique for simultaneous quantification of oxygen radicals and aggregation reveals unexpected redox patterns in the activation of platelets by different physiopathological stimuli. Haematologica. 104 (9), 1879-1891 (2019).
- Fridovich, I. Superoxide radical: An endogenous toxicant. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 239-257 (1983).
- Keele, B. B., Mccord, J. M., Fridovich, I. Superoxide dismutase from Escherichia coli B. A new manganese-containing enzyme. J Biol Chem. 245 (22), 6176-6181 (1970).
- Berry, C. E., Hare, J. M. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: Molecular mechanisms and pathophysiological implications. J Physiol. 555, 589-606 (2004).
- Kim, C., Kim, J. Y., Kim, J. H. Cytosolic phospholipase a(2), lipoxygenase metabolites, and reactive oxygen species. BMB Rep. 41 (2), 555-559 (2008).
- Armstead, W. M., Mirro, R., Busija, D. W., Leffler, C. W. Postischemic generation of superoxide anion by newborn pig brain. Am J Physiol. 255 (2), H401-H403 (1988).
- Mayer, B., et al. Nitric oxide synthase-catalyzed activation of oxygen and reduction of cytochromes: Reaction mechanisms and possible physiological implications. J Cardiovasc Pharmacol. 20, S54-S56 (1992).
- Du, G., Mouithys-Mickalad, A., Sluse, F. E. Generation of superoxide anion by mitochondria and impairment of their functions during anoxia and reoxygenation in vitro. Free Radic Biol Med. 25 (9), 1066-1074 (1998).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Jiang, F., Zhang, Y., Dusting, G. J. Nadph oxidase-mediated redox signaling: Roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol Rev. 63 (1), 218-242 (2011).
- Wang, Z., et al. The role of mitochondria-derived reactive oxygen species in hyperthermia-induced platelet apoptosis. PLoS One. 8 (9), e75044 (2013).
- Wachowicz, B., Olas, B., Zbikowska, H. M., Buczynski, A. Generation of reactive oxygen species in blood platelets. Platelets. 13 (3), 175-182 (2002).
- Vara, D., et al. Nadph oxidases are required for full platelet activation in vitro and thrombosis in vivo but dispensable for plasma coagulation and hemostasis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 41 (2), 683-697 (2021).
- Violi, F., Pignatelli, P. Platelet nox, a novel target for anti-thrombotic treatment. Thromb Haemost. 111 (5), 817-823 (2014).
- Begonja, A. J., et al. Platelet NAD(P)H-oxidase-generated ros production regulates alphaiibbeta3-integrin activation independent of the NO/CGMP pathway. Blood. 106 (8), 2757-2760 (2005).
- Vara, D. S., et al. Autocrine amplification of integrin αIIbβ3 activation and platelet adhesive responses by deoxyribose-1-phosphate. Thromb Haemost. 109 (6), 1108-1119 (2013).
- Essex, D. W. The role of thiols and disulfides in platelet function. Antioxid Redox Signal. 6 (4), 736-746 (2004).
- Arthur, J. F., et al. Ligand binding rapidly induces disulfide-dependent dimerization of glycoprotein vi on the platelet plasma membrane. J Biol Chem. 282 (42), 30434-30441 (2007).
- Arthur, J. F., Gardiner, E. E., Kenny, D., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet receptor redox regulation. Platelets. 19 (1), 1-8 (2008).
- Kim, K., Li, J., Tseng, A., Andrews, R. K., Cho, J. Nox2 is critical for heterotypic neutrophil-platelet interactions during vascular inflammation. Blood. 126 (16), 1952-1964 (2015).
- Hosseini, E., Solouki, A., Roudsari, Z. O., Kargar, F., Ghasemzadeh, M. Reducing state attenuates ectodomain shedding of GPVI while restoring adhesion capacities of stored platelets: Evidence addressing the controversy around the effects of redox condition on thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 50 (1), 123-134 (2020).
- Jang, J. Y., et al. Reactive oxygen species play a critical role in collagen-induced platelet activation via SHP-2 oxidation. Antioxid Redox Signal. 20 (16), 2528-2540 (2014).
- Beckman, J. S., Koppenol, W. H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: The good, the bad, and ugly. Am J Physiol. 271 (5), C1424-C1437 (1996).
- Koppenol, W. H., Kissner, R., Beckman, J. S. Syntheses of peroxynitrite: To go with the flow or on solid grounds. Methods Enzymol. 269, 296-302 (1996).
- Cammisotto, V., et al. Nox2-mediated platelet activation by glycoprotein (GP) VI: Effect of rivaroxaban alone and in combination with aspirin. Biochem Pharmacol. 163, 111-118 (2019).
- Yang, M., et al. Platelet CD36 promotes thrombosis by activating redox sensor ERK5 in hyperlipidemic conditions. Blood. 129 (21), 2917-2927 (2017).
- Yang, M., et al. Platelet CD36 signaling through ERK5 promotes caspase-dependent procoagulant activity and fibrin deposition in vivo. Blood Adv. 2 (21), 2848-2861 (2018).
- Freedman, J. E. Oxidative stress and platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), s11-s16 (2008).
- Masselli, E., et al. ROS in platelet biology: Functional aspects and methodological insights. Int J Mol Sci. 21 (14), 4866 (2020).
- Madamanchi, N. R., Vendrov, A., Runge, M. S. Oxidative stress and vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (1), 29-38 (2005).
- Riemersma, R. A., et al. Risk of angina pectoris and plasma concentrations of vitamins a, c, and e and carotene. Lancet. 337 (8732), 1-5 (1991).
- Rimm, E. B., et al. Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl J Med. 328 (20), 1450-1456 (1993).
- Zhang, W., Zheng, Y., Yan, F., Dong, M., Ren, Y. Research progress of quercetin in cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 10, 1203713 (2023).
- Russell, C., Keshavamurthy, S., Saha, S. Nutraceuticals in the management of cardiovascular risk factors: Where is the evidence. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 21 (3), 150-161 (2021).
- Rotariu, D., et al. Oxidative stress – complex pathological issues concerning the hallmark of cardiovascular and metabolic disorders. Biomed Pharmacother. 152, 113238 (2022).
- Hosseini, E., Ghasemzadeh, M., Atashibarg, M., Haghshenas, M. R. O. S. scavenger, n-acetyl-l-cysteine and NOX specific inhibitor, VAS2870 reduce platelets apoptosis while enhancing their viability during storage. Transfusion. 59 (4), 1333-1343 (2019).
- Hosseini, E., Nodeh, F. K., Ghasemzadeh, M. Gamma irradiation induces a pro-apoptotic state in longer stored platelets, without progressing to an overt apoptosis by day 7 of storage. Apoptosis. 28 (7-8), 1141-1153 (2023).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: A scientific statement from the American heart association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Hempel, S. L., Buettner, G. R., O’malley, Y. Q., Wessels, D. A., Flaherty, D. M. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: Comparison with 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123. Free Radic Biol Med. 27 (1-2), 146-159 (1999).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: Challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Burkitt, M. J., Wardman, P. Cytochrome c is a potent catalyst of dichlorofluorescin oxidation: Implications for the role of reactive oxygen species in apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 282 (1), 329-333 (2001).
- Rota, C., Fann, Y. C., Mason, R. P. Phenoxyl free radical formation during the oxidation of the fluorescent dye 2′,7′-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase. Possible consequences for oxidative stress measurements. J Biol Chem. 274 (40), 28161-28168 (1999).
- Rota, C., Chignell, C. F., Mason, R. P. Evidence for free radical formation during the oxidation of 2′-7′-dichlorofluorescin to the fluorescent dye 2′-7′-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase: Possible implications for oxidative stress measurements. Free Radic Biol Med. 27 (7-8), 873-881 (1999).
- Rodig, S. J. Attaching suspension cells to slides for staining. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).
- Abubaker, A. A., Vara, D., Eggleston, I., Canobbio, I., Pula, G. A novel flow cytometry assay using dihydroethidium as redox-sensitive probe reveals NADPH oxidase-dependent generation of superoxide anion in human platelets exposed to amyloid peptide beta. Platelets. 30 (2), 181-189 (2019).
- Gaspar, R. S., et al. Protein disulphide isomerase and NADPH oxidase 1 cooperate to control platelet function and are associated with cardiometabolic disease risk factors. Antioxidants (Basel). 10 (3), 497 (2021).
- Gaspar, R. S., Ferreira, P. M., Mitchell, J. L., Pula, G., Gibbins, J. M. Platelet-derived extracellular vesicles express NADPH oxidase-1 (NOX-1), generate superoxide and modulate platelet function. Free Radic Biol Med. 165, 395-400 (2021).
- Vara, D., et al. NADPH oxidase 1 is a novel pharmacological target for the development of an antiplatelet drug without bleeding side effects. FASEB J. 34 (10), 13959-13977 (2020).
- Lopes-Pires, M. E., et al. Zinc regulates reactive oxygen species generation in platelets. Platelets. 32 (3), 368-377 (2021).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and mitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: Another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Linden, M. D. Platelet flow cytometry. Methods Mol Biol. 992, 241-262 (2013).
- Kauffman, M. E., et al. MitoSOX-based flow cytometry for detecting mitochondrial ROS. React Oxyg Species (Apex). 2 (5), 361-370 (2016).
- Sonkar, V. K., et al. NOX2 NADPH oxidase is dispensable for platelet activation or arterial thrombosis in mice. Blood Adv. 3 (8), 1272-1284 (2019).
- Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor’ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radic Res. 45 (4), 417-430 (2011).
- Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
