Métodos alternativos para la detección de la generación de aniones superóxido en plaquetas

El anión superóxido (_O2^•-) es la ROS funcionalmente más relevante generada en las plaquetas¹. O₂^•- es el producto de la reducción del oxígeno molecular y el precursor de muchas ROS ² diferentes. La dismutación de_O2^•- conduce a la generación de peróxido de hidrógeno (_H2,_O2) a través de reacciones espontáneas en solución acuosa o reacciones catalizadas por superóxido dismutasas (SODs³). Aunque se han sugerido diferentes fuentes enzimáticas (por ejemplo, xantina oxidasa⁴, lipoxigenasa⁵, ciclooxigenasa^{6 y óxido} nítrico sintasa⁷), la respiración mitocondrial ^8,9 y las nicotinamida adenina dinucleótido fosfato-oxidasas (NOXs)¹⁰ son las fuentes más prominentes de anión superóxido en las células eucariotas. Este también parece ser el caso de las plaquetas, donde la fuga de electrones de la respiración mitocondrial^11,12 y la actividad enzimática de los NOX^13,14 se han descrito como los principales contribuyentes a la producción de aniones superóxido.

Aunque varios estudios se han centrado en la regulación de las plaquetas por_O2^•-, no existe consenso sobre los mecanismos moleculares responsables. La modulación de la actividad de los receptores de superficie a través de la oxidación directa y la formación de enlaces disulfuro se ha propuesto para diferentes receptores de plaquetas. Se ha sugerido la regulación positiva de la integrina αIIbβ3 por ROS a través de la oxidación directa de residuos de cisteína 15,16,17. De manera similar, dado que las respuestas plaquetarias al colágeno dependen de la dimerización dependiente de disulfuro y la consecuente dimerización de la glicoproteína VI (GPVI)¹⁸, se ha propuesto la potenciación de la actividad del receptor por oxidación dependiente de^ROS19, aunque no completamente probada experimentalmente. Por último, se demostró que la oxidación inducida por ROS de los grupos sulfhidrilo de la glicoproteína Ib (GPIb) promueve la adhesión plaquetaria y la interacción plaqueta-leucocto durante la inflamación²⁰. Por el contrario, como posible consecuencia de la disminución de la oxidación del grupo sulfhidrilo y de la activación del receptor, el desprendimiento del ectodominio de GPVI y GPIb se ve disminuido por las condiciones reductoras²¹.

También se han propuesto modos de acción independientes de la oxidación directa de los receptores de superficie plaquetaria. Se ha demostrado que las ROS, incluida la_O2^•-, modulan positivamente el receptor de colágeno GPVI al atenuar la actividad de la proteína tirosina fosfatasa 2 (SHP-2) que contiene la región de homología Src 2, que regula negativamente la cascada de señalización de este receptor²². Además, el_O2^•- puede generar ONOO^– (peroxinitrito) por reacción rápida con el óxido nítrico (NO), que normalmente inhibe las plaquetas a través de la guanilil ciclasa sensible al NO (NO-GC) y la generación del regulador plaquetario negativo GMP cíclico (cGMP)^23,24. La disminución resultante en los niveles de NO puede conducir a la potenciación de las plaquetas. Alternativamente, se ha sugerido que la generación de_O2^•- por NOX2 contribuye a la peroxidación lipídica y a la formación de isoprostano, que es esencial para la activación y adhesión plaquetaria²⁵. Por último, la proteína quinasa 5 (ERK5) regulada por señales extracelulares activada por mitógenos (MAPK), una proteína quinasa propuesta como sensor de estrés redox en las plaquetas²⁶, es activada por O₂^•- e induce un fenotipo procoagulante en las plaquetas (según lo estimado por la medición de la externalización de la fosfatidilserina basada en citometría de flujo)²⁷.

La desregulación de la_O2^•- y otras ROS generadas en las plaquetas se ha asociado con la respuesta hemostática exagerada que conduce a complicaciones cardiovasculares trombóticas asociadas con aterosclerosis, diabetes mellitus, hipertensión, obesidad y cáncer^28,29. En estos entornos patológicos, la producción de ROS por parte de las plaquetas aumenta, lo que conduce a una potenciación de sus respuestas adhesivas y agregatorias. Además del efecto sobre las respuestas plaquetarias, la producción de radicales libres de las plaquetas puede tener consecuencias sobre otras células sanguíneas y estructuras vasculares, que es un área poco conocida y poco investigada de la salud cardiovascular³⁰. A pesar de nuestra limitada comprensión de los mecanismos moleculares que relacionan el estrés oxidativo con las afecciones trombóticas, la relevancia clínica de los antioxidantes para la protección contra las enfermedades cardiovasculares ha recibido una atención considerable. Se ha demostrado que los niveles plasmáticos de antioxidantes se correlacionan inversamente con el riesgo de desarrollar afecciones cardiovasculares, y se ha demostrado que el consumo de antioxidantes en la dieta protege contra la enfermedad de las arterias coronarias^31,32. En consecuencia, el uso de antioxidantes dietéticos ha sido defendido como un enfoque prometedor para la prevención de enfermedades cardiovasculares 33,34,35. Entre los efectos de la generación de ROS en las plaquetas, el aumento de la apoptosis puede tener importantes efectos fisiopatológicos^36,37. En general, los protocolos fiables para detectar y cuantificar la producción de_O2^•- por parte de las plaquetas son cada vez más relevantes en la investigación cardiovascular.

En la actualidad, las técnicas disponibles para la detección de ROS tienen importantes limitaciones de especificidad (es decir, se desconoce la naturaleza química de las moléculas oxidantes detectadas) y fiabilidad (es decir, la interacción no deseada con moléculas biológicas y reactivos experimentales conduce a resultados no fisiológicos sesgados)^38,39. El enfoque más utilizado para la detección de ROS en plaquetas se basa en el uso de diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFDA), que se convierte en diclorodihidrofluoresceína (DCFH) por las esterasas intracelulares y, en consecuencia, en diclorofluoresceína (DCF) altamente fluorescente por oxidantes celulares, incluidos los radicales hidroxilo y los intermedios de peroxidasa-H₂O₂ ^40,41. A pesar de su amplio uso, se han planteado serias dudas sobre la fiabilidad de este enfoque para la medición de ROS³⁸ intracelular. De hecho, la oxidación de DCFH a DCF puede ser inducida por iones de metales de transición (por ejemplo, Fe²⁺) o enzimas que contienen hemo (por ejemplo, citocromos) en lugar de ROS⁴². Además, el DCFDA es convertido por las peroxidasas celulares en su forma de radicales libres de semiquinona (DCF^—), que a su vez se oxida a DCF por reacción con el oxígeno molecular (_O2) con la liberación de_O2^–, lo que conduce a la amplificación artificial de las respuestas oxidativas 41,43,44. Por lo tanto, la detección de ROS intracelulares por DCFDA es útil para obtener información inicial, pero requiere una consideración cautelosa y controles experimentales extensos^38,39.

En este estudio se presentan tres técnicas alternativas para la detección y medición del regulador clave de la función plaquetaria O₂^•-1. La primera técnica es la detección mediante DHE y citometría de flujo, que ofrece ventajas de fiabilidad y especificidad sobre la DCFDA. La segunda técnica propuesta aquí también utiliza DHE, pero el método de detección es la fluorescencia de plaquetas vivas, que permite el estudio de la generación de O₂^•- tras la señalización plaquetaria con cinética rápida y resolución de una sola célula. Por último, un protocolo basado en el uso de la sonda de espín de hidroxilamina 1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH) en experimentos de resonancia EPR ofrece la posibilidad de cuantificar la tasa de generación de_O2^•- por las plaquetas y compararla en diferentes condiciones.