Альтернативные методы определения образования супероксид-анионов в тромбоцитах

Супероксид-анион (O₂^•-) является наиболее функционально значимым АФК, образующимся в тромбоцитах¹. O₂^•- является продуктом восстановления молекулярного кислорода и предшественником многих различных АФК ². Дисмутация O₂^•- приводит к образованию перекиси водорода (H₂O₂) в результате спонтанных реакций в водном растворе или реакций, катализируемых супероксиддисмутазами (SODs³). Несмотря на то, что были предложены различные ферментативные источники (например, ксантиноксидаза⁴, липоксигеназа⁵, циклооксигеназа^{6 и} синтаза оксида азота⁷), митохондриальное дыхание ^8,9 и никотинамидадениндинуклеотидфосфатоксидаза (NOXs)¹⁰ являются наиболее заметными источниками супероксид-аниона в эукариотических клетках. То же самое, по-видимому, имеет место и в отношении тромбоцитов, где утечка электронов из митохондриального дыхания^11,12 и ферментативная активность NOXs^13,14 были описаны как основные факторы, влияющие на выброс супероксид-анионов.

Хотя несколько исследований были сосредоточены на регуляции тромбоцитов с помощью O₂^•-, нет единого мнения относительно молекулярных механизмов, ответственных за это. Предложена модуляция активности поверхностных рецепторов путем прямого окисления и образования дисульфидных связей для различных рецепторов тромбоцитов. Предполагается положительная регуляция интегрина αIIbβ3 АФК путем прямого окисления остатков цистеина 15,16,17. Аналогичным образом, поскольку реакция тромбоцитов на коллаген зависит от дисульфид-зависимой димеризации и последующей димеризации гликопротеина VI (GPVI)¹⁸, было предложено потенцирование активности рецептора путем АФК-зависимого окисления19, хотя это и не было полностью доказано экспериментально. Наконец, было показано, что индуцированное АФК окисление сульфгидрильных групп гликопротеина Ib (GPIb) способствует адгезии тромбоцитов и взаимодействию тромбоцитов с лейкоцитами во время воспаления²⁰. И наоборот, как возможное следствие снижения окисления сульфгидрильных групп и активации рецепторов, выделение эктодомена как GPVI, так и GPIb уменьшается при редуцировании условий²¹.

Также предложены способы действия, не зависящие от прямого окисления поверхностных рецепторов тромбоцитов. Было показано, что АФК, включая O₂^•-, положительно модулируют коллагеновый рецептор GPVI за счет ослабления активности области гомологии Src 2, содержащей протеинтирозинфосфатазу 2 (SHP-2), которая отрицательно регулирует сигнальный каскад этого рецептора²². Кроме того, O₂^•- может образовывать ONOO^– (пероксинитрит) путем быстрой реакции с оксидом азота (NO), который в норме ингибирует тромбоциты через NO-чувствительную гуанилилциклазу (NO-GC) и генерацию отрицательного регулятора тромбоцитов циклической GMP (cGMP)^23,24. Возникающее в результате снижение уровня NO может привести к потенцированию тромбоцитов. В качестве альтернативы, предполагается, что образование O₂^•- с помощью NOX2 способствует перекисному окислению липидов и образованию изопростана, что имеет важное значение для активации тромбоцитов и адгезии^. Наконец, митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK) внеклеточная сигнал-регулируемая киназа 5 (ERK5), протеинкиназа, предлагаемая в качестве датчика редокс-стресса в тромбоцитах²⁶, активируется_O2^•- и индуцирует фенотип прокоагулянта в тромбоцитах (что оценивается с помощью измерения экстернализации фосфатидилсерина на основе проточной цитометрии)²⁷.

Нарушение регуляции образования O₂^•- и других АФК в тромбоцитах было связано с преувеличенной гемостатической реакцией, приводящей к тромботическим сердечно-сосудистым осложнениям, связанным с атеросклерозом, сахарным диабетом, гипертонией, ожирением и раком^28,29. В этих патологических условиях выход АФК тромбоцитами увеличивается, что приводит к потенцированию их адгезивных и агрегационных реакций. В дополнение к влиянию на реакцию тромбоцитов, выход свободных радикалов тромбоцитов может иметь последствия для других клеток крови и сосудистых структур, что является плохо изученной и недостаточно изученной областью сердечно-сосудистого здоровья. Несмотря на наше ограниченное понимание молекулярных механизмов, связывающих окислительный стресс с тромботическими состояниями, клиническая значимость антиоксидантов для защиты от сердечно-сосудистых заболеваний привлекла значительное внимание. Было показано, что уровни антиоксидантов в плазме обратно коррелируют с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний, а потребление антиоксидантов с пищей защищает от ишемической болезни сердца^31,32. Следовательно, использование пищевых антиоксидантов было рекомендовано как многообещающий подход к профилактике сердечно-сосудистых заболеваний 33,34,35. Среди эффектов образования АФК в тромбоцитах увеличение апоптоза может иметь важные патофизиологические эффекты^36,37. В целом, надежные протоколы для обнаружения и количественного определения выхода O₂^•- из тромбоцитов становятся все более актуальными в исследованиях сердечно-сосудистых заболеваний.

В настоящее время доступные методы обнаружения АФК имеют существенные ограничения специфичности (т.е. химическая природа обнаруженных молекул окислителя неизвестна) и надежности (т.е. нежелательное взаимодействие с биологическими молекулами и экспериментальными реагентами приводит к смещенным нефизиологическим результатам)^38,39. Наиболее часто используемый подход к выявлению АФК в тромбоцитах основан на использовании дихлордигидрофлуоресцеина диацетата (DCFDA), который превращается в дихлордигидрофлуоресцеин (DCFH) посредством внутриклеточных эстераз и, следовательно, в высокофлуоресцентный дихлорфлуоресцеин (DCF) клеточными окислителями, включая гидроксильные радикалы и промежуточные соединения пероксидазы-H_2O2 ^40,41. Несмотря на его широкое использование, были подняты серьезные вопросы относительно надежности этого подхода для измерения внутриклеточного АФК³⁸. Окисление DCFH до DCF может быть, фактически, индуцировано ионами переходных металлов (например, Fe²⁺) или ферментами, содержащими гем (например, цитохромами) вместо ROS⁴². Кроме того, DCFDA превращается клеточными пероксидазами в свою свободнорадикальную форму семихинона (DCF^•-), которая, в свою очередь, окисляется до DCF в результате реакции с молекулярным кислородом (O₂) с выделением O₂^•-, что приводит к искусственной амплификации окислительных реакций 41,43,44. Таким образом, обнаружение внутриклеточных АФК с помощью DCFDA полезно для получения первоначальных представлений, но требует тщательного рассмотрения и обширного экспериментального контроля^38,39.

В данном исследовании представлены три альтернативных метода обнаружения и измерения ключевого регулятора функции тромбоцитов O₂^•-1. Первый метод заключается в обнаружении с помощью DHE и проточной цитометрии, что дает преимущества надежности и специфичности по сравнению с DCFDA. Второй предложенный здесь метод также использует DHE, но метод детектирования представляет собой флуоресцентную визуализацию живых тромбоцитов, которая позволяет изучать генерацию сигналов O₂^•-на тромбоцитах с быстрой кинетикой и разрешением отдельных клеток. Наконец, протокол, основанный на использовании гидроксиламинового спинового зонда 1-гидрокси-3-метоксикарбонил-2,2,5,5-тетраметилпирролидина (CMH) в экспериментах по резонансу ЭПР, дает возможность количественно оценить скорость образования O₂^•- тромбоцитами и сравнить ее в различных условиях.